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病毒包装相关知识汇总
病毒包装相关知识汇总
应用领域
随着分子生物学的理论及技术方法(特别是重组DNA技术)的迅速发展,人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因,使疾病深入至分子水平研究,于是诞生了基因诊断、基因治疗技术。
基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补,或将正常功能的基因置换的方法。
从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。
当代基因治疗研究的热门方法是将外源DNA或RNA片段导入靶细胞或组织,研究靶基因的上调或抑制情况。
例如,有些异常基因(癌基因、病毒基因),可通过反义核酸技术引入外源片段将其抑制;有些基因本身有治疗作用,体外合成该基因导入体内使其表达丰度提高。
故选择合适高效的基因导入介质系统尤为关键。
而病毒载体已成为当前基因治疗载体研究的热点。
病毒载体的优势:
1、利用病毒天然的感染性进入细胞,感染效率高;
2、病毒的宿主范围广,可以感染分裂细胞和非分裂细胞;
3、病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚,稳定易于改造、易于制备;
4、复杂的装配过程由细胞完成;
5、不同的病毒载体具有不同的表达特点;
6、通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构,安全性高;
7、病毒包装技术经历了多年的研究,已趋于成熟,可用于产业化大量生产
慢病毒包装
技术背景:
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种,慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体。
具有感染谱广泛、可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,成为导入外源基因的有力工具。
目前慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰等研究以及活体动物实验中。
技术原理:
慢病毒载体系统包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息,且能提供慢病毒所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
第三代四质粒慢病毒载体系统,相较于前代慢病毒载体,安全性大大提升。
其包括如下成分:
a.基因转移/表达载体;b.辅助载体。
利用表达载体和辅助载体共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取上清液后纯化病毒,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。
技术特点:
1、直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用。
2、可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3、可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4、无需任何转染试剂,操作简便。
5、可以根据需要选择多种标记。
技术应用:
1、将过表达质粒/干扰质粒转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞;
2、将过表达质粒/干扰质粒转入动物组织,以期获得长期表达;
3、构建稳定过表达/干扰细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内;
4、基因治疗;
5、转基因动物;
6、基因敲除;
7、药物研究:
构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用;
8、快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法。
技术流程概述:
1、基因合成及病毒载体构建
2、转染及验证
3、细胞培养及慢病毒包装
4、收获病毒液及病毒纯化
5、病毒滴度检测
6、感染效果WB或qPCR评价
慢病毒包装常用质粒图谱:
腺病毒包装
技术背景:
腺病毒(Adenovirus,AdV)是一种非整合型双链DNA病毒,在自然界中广泛分布。
虽然一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、上呼吸道或眼部上皮细胞的急性感染;但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的,对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。
根据JournalofGeneMedicine的统计,截至2006年,在全球1192项基因治疗临床试验方案中,有305项(26%)使用腺病毒载体,首次超过反转录病毒,居第一位。
由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道,所以它所介导的基因治疗可以静脉注射,还可以通过口服经肠道吸收,或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收,使得基因治疗方案易于推广应用。
技术原理:
腺病毒(Adenovirus)是一种无包膜的双链线性DNA病毒,基因组长约36kb,衣壳呈规则的20面体结构。
腺病毒外源基因装载容量大,且能够感染绝大多数哺乳动物细胞,包括分裂和不分裂的细胞;除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。
腺病毒适用于在难以转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因和invivo实验。
常用重组腺病毒系统组成:
腺病毒骨架载体(携带腺病毒主要功能基因)、穿梭载体(转移外源基因表达盒到骨架载体上)。
目前应用最为广泛的是AdMax腺病毒载体系统,骨架质粒和穿梭载体共转染293细胞后,在细胞内中通过Cre/loxP实现载体重组,进而产生重组腺病毒。
通过裂解细胞收获病毒粒子,病毒粒子经过反复扩增与纯化可得到高滴度的腺病毒。
技术特点
1、几乎可以感染所有类型的细胞,包括分裂细胞和非分裂细胞;
2、可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒;
3、病毒滴度高,产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL;
4、腺病毒载体感染宿主的范围比较广,制备容易,操作简单;
5、感染细胞时,不整合到染色体中,不存在激活致癌基因或插入突变等危险,生物安全性高。
技术应用
1、应用于体内接种疫苗。
用携带免疫调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应肿瘤细胞以诱导抗肿瘤免疫反应,可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。
2、应用于信号转导,基因转位,coIP,动物实验,干细胞研究等科研实验。
3、可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
4、产生滴度高,非常适于基因治疗。
技术流程
1、构建穿梭质粒
以含目的基因的质粒为模板,分别在两个酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,双酶切后插入穿梭质粒。
2、细胞转染
将取骨架质粒和穿梭质粒转染293细胞。
3、将PacI消化后的腺病毒表达载体转染AD293细胞,收获细胞以制备病毒粗提液。
4、将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。
5、收集病毒颗粒分装,-80℃保存。
腺病毒包装常用质粒图谱
腺相关病毒包装
技术背景:
腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV),属于微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。
AAV的基因组约4800bp,两个ITR序列和两个开放阅读框。
AAV具有多种常见血清型,100多种病毒变种。
其中AAV2是目前应用最广的腺相关病毒,对多数常见细胞均有较好效果。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被广泛用于体内实验研究,且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
腺相关病毒载体整合率远低于慢病毒载体,但其可以以染色体外形式长期(数月至数年)存在于非分裂细胞中,从而实现外源基因长期表达。
技术原理:
常用腺相关病毒载体系统AAVHelper-FreeSystem,能产生AAV2血清型病毒而无需辅助病毒。
该系统包含3个质粒:
1个重组表达质粒和2个辅助质粒。
将目的基因克隆至重组pAAV载体上;将AAV感染必须的腺病毒基因(E2A、E4及VA等)构建至辅助质粒pHepler上,将AAV复制基因rep和capsid结构基因cap构建至质粒pAAV-RC上。
三质粒共转染表达腺病毒E1基因细胞,在细胞中进行病毒的包装。
通过裂解细胞,离心取得上清液后进一步浓缩纯化,收集病毒。
技术特点:
1、安全,AAV不参与任何疾病的发生,已经用于临床疾病治疗;
2、感染范围广,可以用于神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药;
2、滴度高,颗粒小,扩散能力强;
3、表达稳定,可持续半年以上;
4、外源基因定向重组,免疫原性低,极少发生非特异反应和免疫抑制,适合于进行基因治疗研究。
技术流程:
1、病毒载体构建
2、腺相关病毒包装
3、腺相关病毒浓缩与纯化
4、病毒滴度检测
腺相关病毒包装常用质粒图谱:
附1:
12种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性
血清型
组织亲和性
AAV1
肌肉,心脏,骨骼肌(包括心肌),神经组织
AAV2
中枢神经,肌肉,肝脏,脑组织,眼,
AAV3
肌肉,肝脏,肺,眼
AAV4
中枢神经,肌肉,眼,脑
AAV5
肺,眼,中枢神经,关节滑膜,胰腺
AAV6
肺,心脏
AAV7
肌肉,肝脏
AAV8
肝脏,眼,中枢神经,肌肉
AAV9
心脏,肌肉,肺(肺泡),肝脏,中枢神经
DJ
肝脏,视网膜,肺,肾脏
DJ/8
肝脏,眼,中枢神经,肌肉
Rh10
肺,心脏,肌肉,中枢神经,肝脏
附2:
常见的病毒载体及生物学特性比较:
随着基因治疗的广泛应用,科学家们陆续开发出多种病毒载体,用于外源基因导入靶细胞或组织。
这些病毒载体各有优点,其中,慢病毒包装简单、周期短、可稳定表达;腺病毒滴度高、感染及表达蛋白的能力强;腺相关病毒安全性高、表达稳定。
在实验中,均需根据自己的实验目的进行实际选择。
特将这三种病毒的生物学特性整理如下:
慢病毒(Lentivirus)
腺相关病毒(AAV)
腺病毒(Adenovirus)
病毒类型
RNA
ssDNA
dsDNA
包装容量
8kb
<5kb
8kb
包膜
有
无
无
颗粒直径
90-100nm
20-30nm
60-90nm
包膜
有
无
无
基因组
dsRNA
ssDNA
dsDNA
表达起始时间
48-72h
72-96h
24-48h
表达持续时间
>2months
>6months
~1month
宿主基因组整合方式
随机高频整合
定向低频整合或非整合
非整合
亲噬性
感染谱广
感染谱广
感染谱广
免疫原性
低
低
高
主要缺点
随机整合存在引发肿瘤的可能性
包装容量小
免疫原性低,无致病性
主要优点
在大部分组织中获得稳定表达
免疫原性强
大部分组织都可以获得较高感染效率
附3:
如何根据实验目的选择合适的病毒载体
项目
慢病毒(LV)
腺病毒(Ad)
腺相关病毒(AAV)
体内实验
静脉注射
-
+
+++
定点注射
++
++
+++
细胞回输
+++
-
-
体外实验
过表达
+++
+++
-
干扰
+++
+++
-
MicroRNA
+++
++
-
前沿研究
CRISPR/Cas9
+++
-
-
CAR-T
+++
-
-
自噬
+++
-
-
光遗传
++
-
+++
附4:
病毒包装常见问题与解答
——综合问题
1、病毒包装的关键是什么?
病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。
2、病毒载体种类应如何选择?
答:
稳定长时表达研究选择慢病毒,比如稳转细胞株筛选;病毒使用量大选择腺病毒,比如老鼠实验;基因治
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