基因工程.docx
- 文档编号:9442240
- 上传时间:2023-02-04
- 格式:DOCX
- 页数:78
- 大小:139.85KB
基因工程.docx
《基因工程.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因工程.docx(78页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
基因工程
一、名词解释
基因gene:
是遗传的物质基础,是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA分子片段。
基因组genome该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子
操纵子operon:
原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起,转录生成一个mRNA,然后分
别翻译成几种不同的蛋白质。
这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶,或共同完成某种功能。
这些结构基因与其上游的启动子,操纵基因共同构成转录单位,称操纵子。
启动子promoter:
是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件,包括至少一个转录起始点。
在真
核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。
有时,将结构密切联系而无法区分的启动子、
增强子样结构统称启动子。
(DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位,也是转录开始的部位):
DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列
增强子enhancer:
是一种能够提高转录效率的顺式调控元件,最早是在SV40病毒中发现的长约200bp
的一段DNA,可使旁侧的基因转录提高100倍,其后在多种真核生物,甚至在原核生物中都
发现了增强子。
增强子通常占100~200bp长度,也和启动子一样由若干组件构成,基本核
心组件常为8~12bp,可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。
基因表达geneexpression:
是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译变成
具有生物活性的蛋白质分子。
基因工程GeneEngineering:
在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接,构成重组DNA分子并导入相应受体细胞,使外源基因在受体细胞中进行复制、表达,使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。
简单概括,就是将外源目的基因与载体重组后再进入宿主细胞的过程。
(按照预先设计好的蓝图,利用现代分子生物学技术,特别是酶学技术,对一种生物(供体)的遗传物质(DNA)直接进行体外重组操作与改造,并转移到另外一种生物(受体)中去,从而实现受体生物的定向改造与改良):
在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构建遗传物质的新组合,并使之渗入到原先没有这类分子的寄主细胞内,而能持续稳定地繁殖。
载体vector:
能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质,在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。
三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
(携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
化学本质:
DNA1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件)携带外源DNA进入宿主细胞,并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。
转化transformation:
指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌,并使其获得新的表型的过程。
受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。
感染infection:
利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法。
转导transduction:
由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。
它是细菌之间传递遗传物质的方
式之一。
其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。
通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程:
通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程
转染transfection:
指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
常用的方法有电穿孔法,磷酸钙共沉淀法,脂质体融合法等。
将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
DNA变性denaturation/melting:
DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。
变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂,碱基间的堆积力遭到破坏,但不涉及到其一级结构的改变。
DNA复性renaturation:
变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。
退火annealing:
指模板双链DNA经热变性,螺旋解开成单链后,通过缓慢冷却到55℃左右,使引物(即具有互补碱基的RNA片段)与该模板DNA单链重新配对,形成新的双链分子的过程。
DNA芯片chip:
是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,即可获得样品的遗传信息。
由于常用计算机硅芯片作为固相支持物,所以称为DNA芯片。
错义突变missensemutation:
碱基替换的结果引起氨基酸顺序的变化。
基因诊断genediagnosis:
又称DNA诊断或分子诊断,通过分子生物学和分子遗传学的技术,直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常,从而对疾病做出判断。
DNA重组DNArecombination:
是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合,形成新DNA分子的过程。
克隆clone:
科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆,这门生物技术叫克隆技术,其本身的含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
(是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体)
DNA克隆:
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子,继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子,即DNA克隆。
基因载体:
基因载体是把基因导入细胞的工具,他的作用是①运载目的基因进入宿主细胞,②使之能得到复制和进行表达。
质粒(plasmid)是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质,为双股闭合环形的DNA,存在于细胞质中,质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状,如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。
质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性,与细菌的遗传变异有关。
限制性核酸内切酶restrictionendonuclease:
是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列,并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。
基因文库genelibrary:
将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增,得到分子克隆的混合体,这样一个混合体称为基因文库。
RFLP:
RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异,这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
核酸探针:
是指与特定的靶分子发生特异性相互作用,并可被特殊的方法探知的分子。
抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。
转录transcription:
转录是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。
作为蛋白质生物合成的第一步,转录是mRNA以及非编码RNA(tRNA、rRNA等)的合成步骤。
分子克隆技术molecularcloning:
指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术
黏性末端cohesiveterminus/stickyends:
是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构,它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来
DNA连杆,是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头adaptor它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端,另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后,便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子,而易于连接重组。
目的基因targetgene:
基因工程中克隆的目标DNA分子
S-D序列S-DSequence:
在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上,含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3,末端碱基互补的序列,该序列最初由Shine、Dalgarno发现,故后来命名为Shine—Dalgarno序列,简称S-D序列。
:
mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16SrRNA3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始:
核糖体结合位点
基因组文库genomiclibrary:
某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中,这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA:
以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库cDNAlibrary:
是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合:
某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组,贮存在一个受体菌的群体中,这个群体就称为cDNA文库。
从组织细胞中分离得到纯化的mRNA,然后以mRNA为模板,利用逆转录酶合成其互补DNA,再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后导入受体菌内,扩增,构建cDNA文库。
转化子(transformant):
通过转化方式而形成的杂种后代。
导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞
重组子recon:
含有重组DNA分子的转化子
感受态:
指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。
重组子的筛选:
经过各种方法将外源DNA分子导入受体,获得所需目的重组子的过程
选择:
转化子的初步筛选:
通过某种外加压力(如:
抗生素)的辨别作用,呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。
筛选screening:
进一步检测目的重组子:
通过某种特定的方法,从受体细胞群体或基因文库中,鉴定出目的重组子的过程。
终止子terminator:
在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往还有一特定的核苷酸序列,它有终止转录的功能,这一DNA序列称为转录终止子
融合蛋白fusionprotein:
是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码,C端由真核DNA的完整序列编码。
Southern印迹Southernblotting:
Southern发明的一种影印转移物质的方法。
黏粒载体Cosmidvector:
含有cos位点的质粒载体。
RACE:
是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3,或5,端之间未知序列的方法。
探针Probe:
指被标记物质标记了的核酸。
逆转录PCRRT-PCR:
先用逆转录酶作用于mRNA,以寡聚dT为引物合成cDNA第一链,然后用已知一对引物,扩增嵌合分子,这种方法称为逆转录PCR。
插入失活Insertinactivation,基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点,在该位点用相应的限制性内切酶处理,并将外源DNA片段插入该位点,则插入的外源DNA片段将破坏原有基因的读码框,往往导致原有的选择标记基因无法翻译表达,或即使翻译表达,形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质,这一现象称为插入失活。
。
穿梭质粒载体Shuttleplasmidvector:
指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记,因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
多克隆位点MCS:
指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。
穿梭载体:
人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
指带有两种宿主复制子,因而能在两种生物体内复制的载体分子。
southern杂交:
DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。
被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。
PCR:
聚合酶链反应PolymeraseChainReaction,通过模拟体内DNA复制的方式,在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。
克隆:
(名词)是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。
(动词)是指产生在遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体的过程。
同裂酶isoschizomers:
同尾酶isocaudamer:
星活性staractivity:
一、选择题(每题1分,共15分)
下列有关基因的叙述,错误的是【A】
A蛋白质是基因表达的唯一产物B基因是DNA链上具有编码功能的片段
C基因也可以是RNAD基因突变不一定导致其表达产物改变结构
基因工程的单元操作顺序是【B】
A增,转,检,切,接B切,接,转,增,检
C接,转,增,检,切D切,接,增,转,检
生物工程的上游技术是【A】
A基因工程及分离工程B基因工程及发酵工程
C基因工程及酶工程D基因工程及细胞工程
下列各组专业术语中,含义最为接近的是【C】
A终止子与终止密码子B基因表达与基因转译
CDNA退火与DNA复性D重组子与转化子
根据酶切活性对盐浓度的要求,限制性核酸内切酶可分成【B】
A2大类B3大类C4大类D5大类
T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起,其底物的关键基团是【D】
A2'-OH和5'–PB2'-OH和3'-P
C3'-OH和2'–PD5'-OH和3'-P
下列有关连接反应的叙述,错误的是【A】
A连接反应的最佳温度为37℃
B连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%
C连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mM
D连接酶通常应过量2-5倍
原生质体转化方法不大适用于【A】
A大肠杆菌B枯草杆菌C酵母菌D链霉菌
下列各常用载体的装载量排列顺序,正确的是【A】
ACosmid>λ-DNA>PlasmidBλ-DNA>Cosmid>Plasmid
CPlasmid>λ-DNA>CosmidDCosmid>Plasmid>λ-DNA
若某质粒带有lacZ标记基因,那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【D】
A半乳糖B异丙基巯基-β-半乳糖苷(IPTG)
C蔗糖D5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)
下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中,错误的是【C】
A大肠杆菌-繁殖迅速B枯草杆菌-分泌机制健全
C链霉菌-遗传稳定D酵母菌-表达产物具有真核性
分子杂交的化学原理是形成【D】
A共价键B离子键C疏水键D氢键
某一重组DNA(6.2kb)的载体部分有两个SmaI酶切位点。
用SmaI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子,其长度总和与已知数据吻合,该重组分子插入片段上的SmaI酶切位点共有【D】
A4个B3个C2个D至少2个
下列设计的探针中,最佳的是【D】
AACATTAAATTATTBGGGCA
CACCTTGATAAGGTDCGGACTTGACCATC
cDNA法获得目的基因的优点是【A】
A成功率高B不含内含子C操作简便D表达产物可以分泌
限制性核酸内切酶是由细菌产生的,其生理意义是【D】
A修复自身的遗传缺陷B促进自身的基因重组
C强化自身的核酸代谢D提高自身的防御能力
生物工程的下游技术是(a)
A基因工程及分离工程B蛋白质工程及发酵工程
C基因工程及蛋白质工程D分离工程及蛋白质工程
基因工程操作常用的酶是:
(I内切酶II连接酶III末端转移酶IV聚合酶(a)
A.I+IIB.I+III+IVC.II+III+IVD.I+II+IV+III
限制性内切核酸酶的星活性是指:
(d)
A在非常规条件下,识别和切割序列也不发生变化的活性。
B活性大大提高
C切割速度大大加快
D识别序列与原来的完全不同
下列五个DNA片段中含有回文结构的是(d)
A.GAAACTGCTTTGACB.GAAACTGGAAACTG
C.GAAACTGGTCAAAGD.GAAACTGCAGTTTC
关于cDNA的不正确的提法是:
(c)
A同mRNA互补的单链RNA
B同mRNA互补的含有内含子的DNA
C以mRNA为模板合成的双链RNA
D以上都不正确
下列有关连接反应的叙述,错误的是(a)
A.连接反应的最佳温度为37℃
B.连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%
C.连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mM
D.连接酶通常应过量2-5倍
T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起,其底物的关键基团是(c)
A.2'-OH和5'–PB.2'-OH和3'-P
C.3'-OH和5'–PD.5'-OH和3'-P
载体的功能是(d)
A.外源基因进入受体的搭载工具
B.不能为外源基因提供整合能力
C.不能提供复制能力
D.不能为外源基因提供表达能力
黏性末端连接法,不仅操作方便,而且(c)
A产生新切点B易于回收外源片段
C载体不易环化D影响外源基因的表达
下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?
(c)
A质粒
B黏粒
C酵母人工染色体(YAC)
Dλ噬菌体
考斯质粒(cosmid)是一种(b)
A.容量最大一种载体
B.由λ-DNA的cos区与一质粒重组而成的载体
C.是一种单链DNA环状载体
D.不能在受体细胞内复制,但可以表达
某一重组DNA的载体部分有两个BamHI酶切位点。
用BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子,其长度总和与已知数据吻合,该重组分子插入片段上的BamHI酶切位点共有(d)
A.4个B.3个C.1个D.2个
下列哪一种酶作用时需要引物?
(c)
A限制酶B末端转移酶C反转录酶DDNA连接酶
用下列方法进行重组体的筛选,只有(c)说明外源基因进行了表达。
(a)Southem印迹杂交(b)Northem印迹杂交
(c)Western印迹(d)原位菌落杂交
三、简答题(每题5分,共25分)
1、理想质粒载体的必备条件?
答:
⑴具有较小的分子质量和较高的拷贝数。
⑵具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。
⑶具有两种以上的选择标记基因。
⑷缺失mob基因。
⑸插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并自制和表达。
2、核酸操作的基本技术有哪些?
答:
①核酸提取与纯化
②核酸的检测与保存
③核酸的凝胶电泳
④核酸分子杂交
3、影响核酸保存的关键因素是什么?
怎样保存核酸制品?
答:
关键因素:
①保存液的酸碱度②保存温度
保存方法:
①一般保存可用浓盐液,NaCL-柠檬酸缓冲液或0.1mol/L醋酸缓冲液。
②对DNA来说,在pH4~11的范围分子的碱基较稳定,超出此范围DNA易变性或降解,低温、稀碱下保存DNA及低温下保存RNA均较稳定。
③固态核酸通常在0℃以上低温干燥保存即可。
4、合成cDNA第二链的主要策略有哪些?
答:
①自身引导合成法
②置换合成法
③PCR合成法
④快速扩增cDNA末端法
⑤双链cDNA末端的处理
⑥cDNA与载体的连接
5、基因工程诞生的理论基础是什么?
答:
是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现:
①证实了DNA是遗传物质
②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理
③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定
技术上的三大发明:
①限制核酸内切酶的发现与DNA切割
②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
③基因工程载体的研究与应用
6PCR技术主要应用在哪些领域?
答:
①核酸基础研究
②序列分析
③检测基因表达
④从cDNA文库中放大特定序列
⑤研究已知片段邻近基因或未知DNA片段
⑥进化分析
⑦医学应用
⑧分析生物学证据
⑨性别控制
⑩转基因检测。
7细菌的限制与修饰系统有什么意义?
大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示的4种表型是什么?
?
答:
宿主控制的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中,它有两方面的作用,一是保护自身DNA不受限制;二是破坏入侵外源DNA使之降解。
细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。
外源DNA可以通过多种方式进入某一生物体内,但是它必须被修饰成受体细胞的限制内切酶无法辩认的结构形式,才能在寄主细胞内得以生存,否则会很快被破坏。
因此,在基因工程中,常采用缺少限制作用的菌株作为受体,以保证基因操作的顺利完成。
大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示,它有以下4种表型:
rk+mk+野生型
rk-mk+限制缺陷型
rk-mk-限制和修饰缺陷型
rk+mk-修饰缺陷型
8试述5′RACE技术原理和方法。
答:
PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术(RACE)。
如果已知mRNA的一片段链内短序列,据此或设计基因特异引物,用原先存在的poly(A)尾(3′末端)或附加的同聚尾(5′末端)互补的序列做末端引物,就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。
为获得5′末端部分cDNA克隆需用基因特异引物,产物第一链产物,可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly(A)尾。
通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。
9大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点?
真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍?
答:
特点:
大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉,基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚,对其基因表达调控的分子机理也比较了解,而且历经二十年的基因工程实践,大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系,有多种适用的寄主菌株和载体系列,大肠杆菌易于进行工业化批量生产。
存在的障碍:
第一,在大肠杆菌的mRNA的核糖体结合位点上,含有一个起始密码子及16S核糖体RNA3′末端碱基互补序列,即S-D序列,而真核上缺泛这个序列。
第二,许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰,如正确的折叠和组装,而细菌中通常并没有这样的修饰机制,从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。
第三、
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因工程