DNA的生物合成《生物化学》复习提要.docx
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DNA的生物合成《生物化学》复习提要
DNA的生物合成
遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上,称为复制,这是生物体内高分子的聚合过程,即DNA的生物合成。
第一节复制的基本规律
一、半保留复制
(一)半保留复制的定义
复制时,母链的双链DNA解开成两股单链,各自作为模板指导子代合成新的互补链。
子代细胞的DNA双链,其中一股单链从亲代完整地接受过来,另一股单链则完全重新合成。
由于碱基互补,两个子细胞的DNA双链,都和亲代母链DNA碱基序列一致。
这种复制方式称为半保留复制(semi-conservativereplication)。
(二)半保留复制的实验依据
把细菌放在含15NH4Cl的培养液中培养若干代,分离出的DNA是含15N的“重”DNA,密度比一般含14N的DNA高。
用密度梯度离心法,15N-DNA形成的致密带位于普通14N-DNA所形成的致密带的下方。
把含15N-DNA的细菌放回含普通的NH4Cl培养液中培养。
细菌在营养条件充足时,20分钟就可以生长成新一代。
提取子一代的DNA再作密度梯度离心分析,发现其致密带介于重带与普通带之间,看不到有单独的重带或普通DNA带。
实验结果说明:
子一代DNA双链中有一股是15N单链,而另一股是14N单链。
前者是从亲代接受和保留下来的,后者则是完全新合成的。
密度梯度离心实验,完全支持半保留复制的设想。
含15N-DNA的细菌在普通培养液中继续培育出子二代,其DNA则是中等密度的DNA与普通DNA各占一半这也进一步证明复制是采取半保留式的。
实验还可按子3代、子4代……进行下去,15N-DNA则按1/8、1/16…¨的几何级数逐渐被“稀释”掉。
(三)半保留复制的意义
1、使亲代DNA所含的信息以极高的准确度传递给子代DNA分子。
2、DNA通过复制和基因表达这两种主要功能,决定了生物的特性和类型并体现了遗传过程的相对保守性。
遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础,但不是绝对的。
二、双向复制
(一)双向复制的定义
复制时,DNA从起始点(origin)向两个方向解链,形成两个延伸方向相反的复制叉,称为双向复制(bidirectionalreplication)。
(二)原核生物的双向复制
环状DNA,从一个复制起始点开始,向两个相反方向延伸形成两个复制叉。
(三)真核生物的双向复制
真核生物每个染色体有多个起始点,每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉,复制完成时,复制叉相遇并汇合连接。
习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。
复制子是独立完成复制的功能单位。
三、复制的半不连续性
DNA双螺旋的两条链是反平行的,而DNA合成的方向只能是5’→3’。
在DNA复制时,1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同,可以连续复制,叫作前导链(leadingstrand);而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反,不能连续复制,只能分成几个片段(冈崎片段)合成,称之为滞后链(laggingstrand)。
领头链连续复制而随从链不连续复制,就是复制的半不连续复制。
四、复制的高保真性
DNA复制的精确度极高,误差率很低,以保证物种在维持遗传保守性的同时,还要通过变异不断进化。
DNA复制的高度忠实性至少要依赖三种机制:
1、遵守严格的碱基配对规律;
2、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能;
3、复制出错时,DNA聚合酶的即时校读功能。
第二节DNA复制的酶学
一、复制的化学反应
(一)复制的反应体系
1.底物:
四种dNTP:
dATP、dTTP、dGTP、dCTP
2.聚合酶:
依赖DNA的DNA聚合酶,DNA-pol;
3.模板:
指解开成单链的DNA母链;
4.引物:
提供3’-OH末端,使dNP可以依次聚合;
5.其他酶和蛋白质因子。
(二)复制的化学反应
在聚合酶的作用下,一个核苷酸5′-P和相邻的核苷酸上核糖的3′-OH生成磷酸二酯键而逐一聚合的形成多核苷酸链。
(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+l+ppi
DNA链生成过程,DNA新链生成需引物和模板;只能从5′-端向3'-端延长。
二、参与复制的主要酶类
(一)DNA聚合酶
全称:
依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP)缩写:
DNA-pol
活性:
1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性
1.原核生物的DNA聚合酶
DNA-polI、DNA-polII、DNA-polⅢ;
(1)DNA聚合酶Ⅰ:
1①结构特点:
单一多肽链,从N端到C端有3个酶促活性结构域依次排列:
有5′→3′外切酶、3′→5′外切酶和DNA聚合酶活性。
DNAPolI在蛋白酶的作用下,可分为大、小两个片段。
小片段具有5'→3'外切酶活性。
大片段(又称为Klenow片段)具有聚合酶活性及3′→5′外切酶活性,它对核酸技术十分有用。
②DNA-polI在活细胞内的功能
1)5′→3′聚合酶的活性:
对复制和修复中出现的空隙进行填补。
2)3′→5′外切酶活性:
对复制中错误进行即时校读,保证复制的准确性。
3)5′→3′外切酶活性:
可去除RNA引物和突变碱基。
(2)DNA-polII
具有5′→3’聚合酶活性和3’→5′外切酶活性,无5’→3’外切酶活性,它只是在无polI及polⅢ的情况下才起作用,其真正的功能也未完全清楚,可能在损伤修复中有特殊作用。
(3)DNApol-Ⅲ
①结构特点
由10种亚基(αβγδδ′εθτχψ)组成不对称异源二聚体。
核心酶(αεθ)
α亚基:
5′→3′聚合酶活性
ε亚基:
3′→5′外切酶活性和碱基选择功能,是复制保真性所必需
θ亚基可能起组装作用
β亚基:
夹稳模板链并使酶沿模板链滑动
γ-复合物(γ、δ、δ’、χ、ψ、τ):
促进全酶组装至模板及增强核心酶活性
②DNA-polⅢ在活细胞内的功能
5′→3′聚合酶的活性:
是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚合的酶。
3′→5′外切酶活性:
对复制中错误进行即时校读,保证复制的准确性。
是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶
2.真核生物的DNA聚合酶
DNA-polα,β,γ,δ,ε。
DNA-po1δ:
延长领头链和随从链;
DNA—poIα:
合成RNA引物;
DNA-polε:
校读、修复和填补缺口。
DNA—polβ:
在没有其他DNA-pol时发挥催化功能。
DNA—po1γ:
催化线粒体DNA的合成。
(二)与复制起始及解链解旋相关的酶类
在复制起始时需要多种酶和蛋白因子,共同起解开、理顺DNA链,维持DNA在一段时间内处于单链状态的作用。
1.与复制起始及解链相关的酶类及蛋白
(1)DnaA蛋白
DnaA蛋白是由相同亚基组成的四聚体。
复制起始时,DnaA蛋白辨认并结合E.coli上复制起始点oriC,10~20个DnaA蛋白相互靠近形成DNA蛋白质复合体结构,促使oriC局部解链。
(2)DnaB蛋白
解螺旋酶、复制蛋白rep,利用ATP供能,作用于氢键,使DNA双链解开成为两条单链。
(3)DnaC蛋白
DnaC蛋白的作用是将具有解链酶活性的DnaB蛋白运送到复制模板,并协同DnaB蛋白的作用。
2.DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)
DNA拓扑异构酶,改变DNA分子构象,理顺DNA链,使复制能顺利进行。
分类:
拓扑酶Ⅰ和拓扑酶Ⅱ
作用特点:
对DNA分子的作用是既能水解,又能连接磷酸二酯键。
拓扑酶是在复制全过程中都是有作用的。
作用机制
拓扑酶I切断DNA双链中一股,使DNA解链旋转不致打结,适当时候又把切口封闭,使DNA变为松弛状态。
拓扑酶Ⅰ的催化反应不需ATP。
拓扑酶Ⅱ在无ATP时,切断处于超螺旋状态的DNA分子双链某一部位,断端通过切口使超螺旋松弛;在利用ATP供能情况下,断端在拓扑酶催化下恢复连接松弛状态的DNA又进入负超螺旋状态。
3.单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)
模板的DNA总要处于单链状态,而DNA分子只要符合碱墓配对,又总会有形成双链的倾向,以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。
单链DNA结合蛋白的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。
它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动,而是不断地与模板结合、脱离的。
(三)引物酶
DNA聚合酶不能从头合成DNA链,只能延长已有的DNA或RNA引物链。
引物酶(primase)在复制起始时催化引物(primer)合成,提供3-OH末端,使DNA-pol能够催化dNTP聚合。
引物酶属DNA指导的RNA聚合酶,但不同于催化转录过程的RNA聚合酶。
在E.coli,引物酶是dnaG基因的产物DnaG。
(四)DNA连接酶(DNAligase)
连接DNA链3′-OH末端和相邻DNA链的5′-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
特点:
连接酶连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口,它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的作用。
功能:
在复制中起最后接合缺口的作用,在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用,也是基因工程的重要工具酶之一。
第三节DNA生物合成过程
一、原核生物DNA生物合成
(一)复制的起始
1、DNA解链
DnaA蛋白辨认起始点oriC的重复序列,并与DNA形成起始复合物;DnaB蛋白在DnaC蛋白协助解开双螺旋;SSB维持单链模板稳定
2、引发体的形成并合成引物
DnaB蛋白和DnaA、DnaC蛋白,还有其他复制因子,一起形成复合体,结合引物酶,形成较大的聚合体,再结合到模板DNA上,这种复合物称为引发体。
引发体的蛋白质部分在DNA链上可以移动,并需由ATP供给能量。
引发体到达适当位置就可按照模板的配对序列,催化NTP(不是dNTP)的聚合,生成引物。
DNA复制是半不连续,一股链是可以连续进行的,另一股链是不连续复制的,在不连续复制的链上,引发体需多次生成。
3、超螺旋的转型
解链将导致下游发生打结现象或DNA超螺旋的其他部分过度拧转,拓扑酶通
过切断、旋转和再连结的作用,实现DNA超螺旋的转型,即把正超螺旋变为负超螺旋。
(二)复制的延长
脱氧单核苷酸逐个加入而延长DNA新链,其化学反应本质是生成磷酸二酯键。
催化此反应的酶:
原核生物:
DNA-polⅢ
1、复制延长的生化过程
复制起始时,母链即已解开,两股单链都是模板,其作用是按碱基配对规律指引核苷酸加入到新链。
每次加入的单个核苷酸,都是以dNTP为原料,复制时子链从5’向3’延长。
复制延长速度相当快。
E.coli每秒钟能加入的核苷酸数达2500个。
2、复制的半不连续性和冈崎片段
在形成双螺旋结构时,DNA双链的走向是相反的。
复制经解链后,两股单链在复制叉上也是走向相反。
复制,包括引物合成,只能从5′向3′延伸。
而在同一复制叉上,解链的方向只可能有一个。
复制方向与解链方向不一致,可以理解不连续复制的成因。
(1)领头链连续复制
顺着解链方向而生成的子链,复制是连续进行的,这股链称为领头链(leadingstrand)。
(2)随从链不连续复制
复制的方向与解链方向相反生成的子链称为随从链(laggingstrand)。
随从链的复制必须等待模板链解开至足够长度,才能从5′→3‘方向生成引物然后复制。
随从链在延长时,又要等到下一段暴露出足够长而度的模板,再次生成引物而延长。
这就是不连续复制。
(3)冈崎片段
随从链不连续复制的片段称为冈崎片段,其大小在1000~2000个核苷酸。
每一个不连续复制的片段5’-端都带有一个RNA引物。
片段的复制完成后,RNA引物会被除去而代之以DNA片段,因此复制至最后,两股子链都是DNA链。
(三)复制的终止
原核生物基因是环状DNA,双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。
复制的起始点和终止点刚好把环状DNA分为两个半圆,两个方向各进行180,同时在终止点汇合。
为了定位方便,习惯把E.coli的DNA分为100等分。
E.coli复制起始点oriC在82位点,复制终点ter(termination)在32位点。
二、真核生物的DNA生物合成
(一)复制的起始
真核生物每个染色体有多个起始点,是多复制子复制。
复制有时序性,即复制子以分组方式激活而不是同步起动。
复制的起始需要DNA-polα(引物酶活性)和polδ(解螺旋酶活性)参与。
还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。
增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。
复制起始也是打开复制叉,形成引发体和合成RNA引物。
但详细机制尚未明了。
(二)复制的延长
在复制叉及RNA引物生成后,DNA-polδ通过PCNA的协同作用,逐步取代DNA-polα,在引物的3’-OH基础上分别合成领头链和随从链。
复制子复制完成后,除去引物。
(三)复制的终止
染色体DNA呈线状,复制在末端停止。
复制中岡崎片段的连接,复制子之间的连接。
染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物,去除后留下空隙。
留下的空隙如没法填补,细胞染色体DNA将面临复制一次就缩短一些的问题。
这的确在某些低等生物的特殊生活条件下观察到,但只是少数特例。
事实上染色体虽经多次复制,却不会越来越短的。
因为真核生物染色体线性DNA分子末端存在着特殊的结构称为端粒。
1.端粒(telomere)
(1)端粒的定义:
是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体,是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。
形态学上,染色体末端膨大成粒状,这是因为DNA和它的结合蛋白紧密结合,像两顶帽子那样盖在染色体两端,因而得名。
(2)端粒的结构特点
对多种不同生物端粒的DNA序列测定,发现其共同特点都是富含G碱基的短序列多次重复。
例如,哺乳类动物仓鼠和人类,端粒DNA都有(TTAGGG)n重复可多达数十甚至上百次,并且形成反折式的二级结构。
(3)端粒的功能:
维持染色体的稳定性;维持DNA复制的完整性
2.端粒酶(telornerase)
20世纪的80年代中期发现了端粒酶,它是一种RNA-蛋白质复合物。
端粒酶中的RNA序列常可与端粒区的重复序列互补并作为端粒区重复序列延长的模板。
端粒酶中的蛋白质部分具有逆转录酶活性,能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。
3.合成端粒的过程
复制终止时,染色体线性DNA末端确有可能缩短,但通过端粒的合成可以补偿这种由除去引物引起的末端缩短。
(图11-21)
(1)端粒DNA的3’末端和端粒酶所含的RNA分子的3’端形成碱基配对。
(2)端粒酶利用RNA为模板,将dNTP加到端粒DNA的3’端,这个逆转录过程一直进行到RNA模板的第35位。
(3)DNA-RNA杂交链之间发生相对滑动,端粒DNA链3’端和RNA下游(3’端)形成新的碱基配对,并暴露出部分RNA模板序列。
(4)重复
(2)(3),周而复始直至足够长度。
在上述过程中,离开RNA模板的端粒DNA3’端可反折为双链,并常出现两个G之间的配对,以有利于DNA-RNA杂交链之间的相对滑动。
虽然端粒酶不能直接填补引物去除后留下的空隙,而是在模板链的3’端添加末端重复序列,这样仍能保持染色体的平均长度。
4.端粒和端粒酶的生物学意义
端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。
端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐变短至消失,可导致染色体稳定性下降,导致细胞衰老凋亡。
体细胞几乎没有端粒酶活性,随多次细胞分裂端粒逐渐缩短,细胞失去增殖能力。
而端粒酶活性较高的胚原细胞,端粒长度未缩短。
肿瘤细胞端粒酶重新获得活性,以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。
肿瘤细胞的端粒比正常人同类细胞显著缩短。
第四节逆转录和其他复制方式
一、逆转录
在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。
此过程中,核酸合成与转
录(DNA→RNA)过程遗传信息的流动方向相反(RNA→DNA),故称为逆转录(reversetranscription)。
二、逆转录病毒
RNA病毒的基因组是RNA而不是DNA,其复制方式是逆转录,故称为逆转录病毒(retrovirus)。
RNA病毒感染活细胞后,要先经逆转录成为双链DNA,通过基因重组方式,参加入宿主细胞基因组,并随宿主细胞复制和表达。
这种重组方式称为整合。
病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。
三、逆转录酶
能催化以单链RNA为模板合成双链DNA的反应的酶称为逆转录酶(reversetranscriptase)。
它兼有三种酶的活性:
RNA指导的DNA聚合酶,DNA指导的DNA聚合酶和RNaseH活性。
RNaseH活性是指除去杂合分子中的RNA。
它可以从5′→3′和3′→5′两个方向水解DNA-RNA。
逆转录酶和其他DNA聚合酶一样,合成DNA的方向为5′→3',并且不能从头合成DNA,也需要引物,是病毒本身的一种tRNA。
四、逆转录过程
1.以单链RNA的基因组为模板,在逆转录酶(RNA指导的DNA聚合酶)的催化下,合成一条单链DNA;
2.产物与模板生成RNA∶DNA杂化双链,杂化双链中的RNA被逆转录酶(RNaseH)水解;
3.以新合成的单链DNA为模板,逆转录酶(DNA指导的DNA聚合酶)催化合成第二链的DNA。
五、逆转录酶和逆转录现象的生物学意义
(一)逆转录酶和逆转录现象是分子生物学研究中的重大发现
RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。
(二)对逆转录病毒的研究,拓宽了病毒致癌理论。
(三)分子生物学研究应用逆转录酶(cDNA法),作为获取基因工程目的基因的重要方法之一。
第五节DNA损伤(突变)与修复
一、突变的定义:
个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段DNA在构成、复制或表型功能上的异常变化,称为突变(Mutation),也称为DNA损伤(DNAdamage)。
即遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。
二、突变的意义
(-)突变是进化、分化的分子基础
自发突变或自然突变
(二)突变导致基因型改变
多态性:
个体之间的基因型差别。
(三)突变导致死亡
突变发生在对生命过程至关重要的基因上,可导致个体、细胞的死亡。
(四)突变是某些疾病的发病基础
有害的突变
三、引发突变的因素
(一)自发突变
大量的突变属于自发突变,发生频率只不过10-9左右。
但考虑到高等生物基因组庞大,细胞繁殖速度快,就不难理解它起的作用是不可低估的。
(二)诱发突变
1.物理因素:
主要指紫外线和各种辐射,如紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基发生共价结合,生成嘧啶二聚体。
2.化学因素:
化工原料、化工产品和副产品,各种工业的排放物、农药、食品防腐剂或添加剂,以至汽车排放的废气。
四、突变分子改变的类型
(一)错配(mismatch)
DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。
点突变发生在基因的编码区域,可导致氨基酸的改变。
1. 转换:
发生在同型碱基之间,即嘌呤代替另一嘌呤,或嘧啶代替另一嘧啶。
2.颠换:
发生在异型碱基之间,即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。
(二)缺失、插入和框移突变
缺失:
一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。
插入:
原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。
框移突变:
三联体密码的阅读方式改变,造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变,其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。
(三)重排(rearrangement)
DNA分子内发生较大片段的交换,称为重组或重排。
移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置(倒位),也可以在染色体之间发生交换重组。
四、DNA损伤的修复(DNArepairing)
修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制。
修复的主要类型:
光修复(lightrepairing)、切除修复(excisionrepairing)、重组修复(recombinationrepairing)和SOS修复
(一)光修复
光修复过程是通过光修复酶(photolyase)催化而完成的,仅需300~600nm波长照射即可活化,普遍存在于各种生物,人体细胞中也有发现。
通过此酶作用,可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态,DNA完全恢复正常。
(二)切除修复(excisionrepairing)
细胞内最重要的修复机制,包括去除损伤DNA,填补空隙和连接。
1、原核生物DNA损伤修复:
UvrA,UvrB辨认及结合DNA损伤部位;UvrC在解螺旋酶的协助下切除损伤部位。
DNA-polⅠ和连接酶填补空隙和连接。
2、真核生物DNA损伤修复:
XP类蛋白辨认和切除损伤DNA部位,切除后留下的空隙,则由DNA-polδ及ε加以修复。
(三)重组修复(recombinationrepairing)
当DNA分子的损伤面较大,还来不及修复完善就进行复制时,损伤部位因无模
板指引,复制出来的新子链会出现缺口,这时,就靠重组蛋白RecA的核酸酶活性将另一股健康的母链与缺口部分进行交换,以填补缺口。
损伤链移到己完成复制的链上,如果损伤又只发生在双链DNA中的一股单链,则下一轮的复制损伤链就只占DNA的1/4,不断复制后,其比例就越来越低,称为把损伤链“稀释”掉。
(四)SOS修复
是一类应急性的修复方式。
由于DNA损伤广泛至难以继续复制,由此而诱发出一系列复杂的反应。
在E.coli,各种与修复有关的基因,组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。
特点:
反应特异性低,对碱基的识别、选择能力差。
通过SOS修复,复制如能继续,细胞是可存活的。
然而,DNA保留的错误会较多,引起较广泛、长期的突变。
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