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发酵工程实验报告之果汁澄清
发酵工程学实验
组号:
7-8节第七小组学号:
124120434
学院:
生命科学学院专业、班级:
12生物技术
实验课程名称_发酵工程实验
指导教师及职称唐湘华
开课学期2014至2015学年下学期
云南师范大学教务处编印
实验名称:
(一)特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究
实验时间
第十三周
实验室
睿智3-121
小组合组
是
小组成员
高胜全李朝和刘云谣罗光洪张志豪
一、实验目的:
1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法;
2、了解酶学性质的研究.
二、实验原理:
1、理论依据
(1)、果胶酶概况
(2)、果胶酶的酶活测定方法
(3)、微生物发酵生产特定产物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约
(4)、酶催化反应的进行受多种因素的影响
2、果胶酶概况
果胶质:
是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖,是一类高分子碳水化合物,它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。
果胶酶:
是指能分解果胶质的多种酶的总称,广泛存在于高等植物和微生物中。
产生果胶酶的微生物:
细菌、放线菌、酵母和霉菌,但目前商品果胶酶多数来自霉菌。
果胶酶的应用:
主要是用于果胶的分解,在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
3、果胶酶的酶活测定方法
粘度降低法:
利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内,标准果胶溶液的粘度降低值。
脱胶作用时间法:
以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
次亚碘酸法:
用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量,以表示果胶酶的活力。
还原糖法(DNS法):
测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内,水解果胶产生的还原糖的量。
DNS法:
根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,后者是一种还原糖,与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定的范围内,还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系,可利用比色法在540nm进行测定。
4、微生物发酵生产产品受以下条件制约:
培养基成分:
C源、N源、无机盐、水和生长因子
培养条件:
温度、pH、溶解氧等
附加条件:
诱导物、表面活性剂等
5、酶催化反应的进行受多种因素的影响
底物浓度酶浓度温度pH激活剂抑制剂
三、实验材料
(一)试剂
1、酶活测定用试剂和DNS
2、新鲜果汁
(二)仪器
烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等;
天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器(精确到秒)、分光光度计等。
(三)培养基
1、菌种筛选使用
2、黑曲霉Asp-2固体发酵用
1、菌种筛选使用培养基
⑴基本培养基:
果胶1%,磷酸氢二钠0.5%,蛋白胨1%,pH4.5,琼脂2.0%。
⑵分离培养基
果胶0.5%,磷酸氢二钠0.5%,琼脂2.0%,pH4.5
(3)发酵培养基
果胶1%,磷酸氢二钠0.5%,蛋白胨1%,pH4.5。
2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基
菌种斜面培养基(查氏培养基)
NaNO30.2%K2HPO40.1%
KCl0.05%MgSO40.05%
FeSO40.001%蔗糖3%
琼脂2.5%自然pH
种子培养基
麸皮3.0%,橘子粉2.0%,硫酸铵0.5%,
葡萄糖1%,KH2PO40.1%pH4.5
固体发酵培养基:
5瓶/组
麸皮10g,橘子粉2.5g,(NH4)SO40.1g(0.8%干料计)
葡萄糖0.125g(1%干料计),水15ml
要求:
按组统一配制后分装三角瓶
先将(NH4)SO4、葡萄糖用水溶解,再加其它。
四、实验方法、步骤及注意事项:
(1)固体发酵果胶酶
1、菌种准备
菌种活化:
试管保存菌种→斜面活化→30℃培养约60h
液体培养:
将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内,30℃,200rpm,培养约40h,备用。
2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响(第一组)
选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨,接种5%液体种子,培养48小时,测定酶活。
在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%(按干料计)浓度的已选择的氮源,保持培养基的其它成分不变,在相同接种量(约5%,即1.5ml)相同培养条件下(30℃,60h)发酵,测定酶活。
3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响(第二组)
选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨,接种5%液体种子,培养48小时,测定酶活。
在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%、3.%的选择的碳源,保持培养基的其它成分不变,在相同条件下接种液体种子(约5%,即1.5ml),相同培养条件下,30℃,发酵60h,测定酶活。
4、培养基含水量对产酶的影响(第三组)
在发酵培养基中加入蒸馏水,使培养基中的含水量分别约为50%、55%、60%、65%和70%;保持培养基的其它成分不变,在相同接种量(5%,即1.5ml)相同培养条件下(30℃,48~60h)发酵,测定酶活。
5、接种量对产酶的影响(第三组)
分别以4%、5%、6%、7%和8%的接种量接种果胶酶产生菌于发酵培养基中,在相同的培养条件下(30℃,48~60h)发酵,测定酶活。
注意:
由于接种的是液体菌种,所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。
6、发酵时间对产酶的影响(第四组)
在相同的培养基、相同的接种量(5%,即1.5ml)和相同培养条件下(30℃)分别发酵36、48、60、72和84h,测定酶活。
注意:
精确计算时间,准时取出发酵产物。
7、发酵温度对产酶的影响(第五组)
保持培养基成分和接种量(5%,即1.5ml)不变,分别
在室温、30、37和45℃的温度条件下发酵48-60h,
测定酶活。
先把培养箱调到相应的温度!
8、果胶酶酶活的测定
(1)待测酶液的制备
烘干:
把发酵产物倒于平皿中,45℃烘干过夜;
制备酶粉:
将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状(尽量磨细),装于塑料袋中备用;
制备酶液:
称取0.1g酶粉,充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(稀释100倍),纱布(4层)过滤去除杂质;
如果测定所得OD值不在有效值(0.2-0.6)范围内,则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。
(2)果胶酶酶活测定方法
OD=(A+B)/2
酶活定义:
在pH3.0、37℃条件下,每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式
酶活(U/g)=A×5×K×N×1000/(T×W×M)
A:
样品的OD值(平均值)
K:
标准曲线的斜率
N:
稀释倍数
5:
0.2毫升反应液转换为1毫升体积
T:
反应时间(min)
1000:
转换因子1mmol=1000μmol
W:
半乳糖醛酸的分子量(212.16g/mol)
M:
称取酶粉克数(g)
绘制标准曲线的方法
先配制一系列浓度不同的标准溶液,用选定的显色剂进行显色,在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
以A为横坐标,浓度c为纵坐标,则得到一条拟合度较好的直线,称为标准曲线。
然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度,便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。
半乳糖醛酸标准曲线的制作
精确称取0.100g半乳糖醛酸,用缓冲溶液定容至100ml,制得浓度为1mg/ml的半乳糖醛酸的标准溶液。
标准曲线如下图表所示
(3)注意事项
试管上编号:
贴上用圆珠笔写上编号的胶布,以防止保温或沸水加热时脱落;
移液枪的使用:
向试管内加入待测酶液或DNS时,枪头不要触碰管壁,也不要伸入液面下,连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头!
精确记时:
每一管加入酶液的时间要做记录,每管之间间隔的时间要合理;
避免试管进水:
煮沸和用流水冲洗时;
实验结果的记录与分析
9、仪器的使用
恒温水浴锅
分光光度计
烘箱
移液枪
UV2000型分光光度计的使用注意
提前半小时接通电源,打开机器开关使仪器通电,自检;
将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁,放入样品室;
调节测定所用波长;
读数完毕,打开仪器盖板,关闭开关,将比色杯冲洗干净、浸泡于30%酒精中。
注意事项
1、接种
接种方式是液体→固体,用灭菌的移液管或10ml量筒接种或大枪头;
接种后振荡接种瓶,使菌种充分与固体培养基混合。
2、水浴锅的使用:
水量(蒸馏水)要超过试管中的液面
3、分光光度计使用时注意:
测定OD在540nm、以对照为参比、测定吸光值
4、及时清洗用过的枪头
实验准备内容
(1)黑曲霉Asp-2固体发酵用的培养基
固体发酵培养基:
5瓶/组→注意配方等的不同,做好标记!
(2)灭菌
培养基
其它:
10ml量筒(纱布和报纸包口)、移液管(塞棉花)等
时间:
灭菌45min
注意事项
1、酶粉的选择:
同一大组采用同一酶粉进行应用性质的实验!
2、水浴锅的使用
水浴锅的水量(蒸馏水)要超过试管中的液面
各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行
3、分光光度计使用时注意
OD660nm
以蒸馏水为参比
测定透光率
五、实验报告
(一)、实验结果
本次实验在菌种分离时,已经分离到能产生果胶酶的菌株,但是在后期的培养过程中,发生一点点的错误,导致培养出来的菌种没有酶活,也就是实验失败。
(二)结果分析
从培养的初期来看,实验能得到菌种,说明实验有成功的契机,但是在经过发酵培养之后,菌株没有酶活,也就是在发酵培养时出现意外,本次试验提醒我们做实验和做事要仔细认真,步步为营。
实验名称:
(二)应用发酵制备的酶液进行果汁澄清的应用实验
实验时间
第十四周
实验室
睿智3-121
小组合组
是
小组成员
高胜全李朝和刘云谣罗光洪张志豪
六、实验目的:
了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素
七、实验原理:
1、果胶酶的应用:
主要是用于果胶的分解,在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
2、脱胶作用时间法:
以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
3、次亚碘酸法:
用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量,以表示果胶酶的活力。
4、还原糖法(DNS法):
测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内,水解果胶产生的还原糖的量。
八、实验材料
1、仪器设备:
烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等;
天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器(精确到秒)、分光光度计等。
2、材料:
新鲜果汁、NAOH溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲、DNS试剂
等等。
九、实验方法、步骤及注意事项:
(一)待测酶液的制备
1、制备酶液:
称取1g酶粉,充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(稀释10倍),高速冷冻离心(10000转、5min)去除杂质;
2、根据发酵条件优化实验中测定所得OD值大小,选择酶活最高的酶粉制备酶液。
(二)果汁的制备
1、水果→清洗→破碎→榨汁
2、稀释:
用pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至10倍
(三)果胶酶的应用性实验—果汁澄清实验
1、果汁澄清的基本方法
步骤
样品A管
样品B管
空白管
步骤1
吸取稀释果汁10毫升
吸取稀释果汁10毫升
吸取稀释果汁10毫升
步骤2
45℃保温5min
45℃保温5min
45℃保温5min
步骤3
稀释酶液1mL
稀释酶液1mL
不加
步骤4
45℃精确保温30min
45℃精确保温30min
45℃精确保温30min
步骤5
离心(5000转,5分钟)
离心(5000转,5分钟)
离心(5000转,5分钟)
步骤6
以蒸馏水为参比,660nm测定透光率
以蒸馏水为参比,660nm测定透光率
以蒸馏水为参比,660nm测定透光率
T(透光率)=(A+B)/2△T=︱T-T0︱空白为T0
2、果胶酶添加量对澄清效果的影响(1,2组)
(1)在反应体系中分别加入0.2、0.5、1.0、1.5和2.0ml的果胶酶液
(2)在相同的反应条件(pH3.0,45℃)下处理30min,以蒸馏水为参比分别测定透光率。
3、果汁pH对澄清效果的影响(3,4组)
(1)用0.25mol/LH2SO4和3mol/LNaOH分别调节果汁的pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0;
(2)在反应体系中加入1.0ml的果胶酶液,相同的反应条件(45℃)下处理30min,以蒸馏水为参比分别测定透光率。
4、果汁温度对澄清效果的影响(5,6组)
(1)保持反应体系的其它条件(1.0ml的果胶酶液、pH3.0,30min)不变,分别在室温(温度计测定)、37℃、45℃、50℃、55℃条件下进行反应30Min;
(2)以蒸馏水为参比分别测定透光率。
(四)注意事项
1、水浴锅的使用
(1)水浴锅的水量(蒸馏水)要超过试管中的液面
(2)各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行
2、分光光度计使用时注意
(1)OD660nm
(2)以蒸馏水为参比
(3)测定透光率
一十、实验结果及分析
1、对不同的实验组添加不同的果胶酶的量后得到的结果如下:
(表一)果胶酶添加量对果汁澄清的影响
酶液量(ml)
OD660
平均值(T)
空白(TO)
△T=︱T-T0︱
A管
B管
0.2
45.90%
74.00%
59.95%
11.60%
48.35%
0.5
39.10%
42.70%
40.90%
12.10%
28.80%
1.0
54.30%
37.40%
45.85%
11.40%
34.45%
1.5
21.80%
9.30%
15.55%
11.90%
3.65%
2.0
47.30%
48.90%
48.10%
12.00%
36.10%
根据上表格做出的折线图(图一)如下:
【透光率之差(△T=︱T-T0︱)】
分析:
根据表格数据及折线图中的信息可以看出△T随着酶量的增加逐渐下降,到酶量为1.5ML时突然上升。
但是根据理论分析随着酶量的增加△T的值应该是逐渐上升,直到某一浓度之后不再增加。
出现上图的结果说明实验没有成功,可能的原因有:
(1)可能是测OD值时把管号弄混了;
(2)可能是加酶时出现漏加现象;(3)从表一中A、B管数据的分布来看,该实验数据的准确性太低,波动大,可信度低。
由于种种原因,本次实验未能找出最适加酶量。
2、不同PH的果汁对果汁澄清效果有影响的实验结果如下
(表二)果汁PH对澄清效果的影响
PH
管号
OD660
平均值(T)
空白管(TO)
△T=︱T-T0︱
1.5
A
19.60%
19.50%
20.60%
1.10%
B
19.10%
2.0
A
12.10%
23.50%
20.60%
2.90%
B
35.00%
2.5
A
61.80%
64.00%
20.60%
43.40%
B
66.10%
3.0
A
74.60%
65.50%
20.60%
44.90%
B
66.30%
3.5
A
80.40%
80.50%
20.60%
59.90%
B
80.80%
4.0
A
91.90%
93.50%
20.60%
72.90%
B
95.00%
4.5
A
64.40%
63.00%
20.60%
42.40%
B
61.80%
5.0
A
36.40%
28.00%
20.60%
7.40%
B
20.30%
根据表二做出折线图(图二)如下:
【透光率之差(△T=︱T-T0︱)】
分析:
从表二中的数据来看,A、B两管的数值差距不大,可信度较高,从图二可以看出随着PH的升高△T不断的升高,当达到一定的高度之后,△T又逐渐下降,在PH=4时△T的值达到最高为72.90%。
也就是说当果汁的PH=4时果汁澄清的效果最好,即最适的果汁澄清PH为4。
建议在今后的实验中用PH=4的果汁进行实验,效果会更好。
3、不同反应温度对果汁澄清效果的影响
(表三)不同反应温度对果汁澄清效果的影响
温度(℃)
OD660
平均值(T)
空白(TO)
△T=T-TO
A管
B管
室温(27)
77.40%
76%
76.70%
12.20%
64.50%
37
96.50%
96.60%
96.55%
12.20%
84.35%
45
80.65%
79.60%
80.13%
12.20%
67.93%
50
54.70%
48.20%
51.45%
12.20%
39.25%
55
44.60%
44.50%
44.55%
12.20%
32.35%
根据表三作得折线图(图三)如下:
【透光率之差(△T=︱T-T0︱)】
分析:
从表三的数据可以看到A、B两管的实验数据差距不大,可以采用,从折线图中可以看到,△T的值随着温度的升高而升高,当到达一定的温度时△T的值达到最大,之后△T的值又逐渐下降,曲线呈现抛物线型,有一个最高点(37℃,84.35%),也就说明在温度为37℃时果汁的澄清效果最好。
通过本次实验,我们测量到了果胶酶的最适温度为37℃,建议今后在用道果胶酶时在37℃下使用。
六、实验总结
通过本次实验,我们测量了果胶酶的最适果汁PH、最适反应温度以及最佳的加酶量,得到了该果胶酶的最适果汁PH为PH=4.0,改果胶酶的最适温度为37摄氏度,但是由于种种的原因,我们没有把最佳加酶量测量出来。
在本次实验中,小组的各成员积极参与,协调合作,出色的把我们小组负责的工作完成了。
通过本次实验我们知道了合作的重要性,对于在本次实验中出现的错误,我们会在今后的学习工作中改进的。
七、教师评语及评分:
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