42 分子生物学技术 学案含答案.docx

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42分子生物学技术学案含答案

4.2分子生物学技术学案（含答案）

第第10课时课时分子生物学技术分子生物学技术学习导航学习导航

1.结合教材了解PCR技术的基本操作。

2.理解PCR扩增DNA片段的原理。

3.结合教材，尝试进行目的DNA片段的体外扩增。

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1.了解PCR技术的基本操作。

2.理解PCR的原理。

一.

一.PCR反应程序及原理反应程序及原理1DNA分子的结构1写出各个标号的名称胞嘧啶；腺嘌呤；鸟嘌呤；胸腺嘧啶；脱氧核糖；磷酸基团；胸腺嘧啶脱氧核苷酸；氢键；碱基对；一条脱氧核苷酸链。

2DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端，将磷酸基团的末端称为5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。

答案左链上5端，下3端；右链上3端，下5端。

2细胞内DNA复制条件分析条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶打开DNA双螺旋DNA聚合酶催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点3PCR技术1概念在体外快速扩增特定基因或DNA序列目的DNA片段的技术称为PCR技术。

2物质条件DNA模板.四种脱氧核苷酸.TaqDNA聚合酶.引物。

3PCR反应的过程及结果PCR反应程序a变性在94高温下，作为模板的双链DNA解旋为单链DNA。

b退火复性反应体系的温度降至55，引物与作为模板的单链DNA上的特定部位相互配对。

c延伸反应体系的温度回升到72左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。

结果aPCR扩增一般要经历三多次循环，每次循环都包括变性.退火.延伸三步。

b两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。

1PCR原理PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同请分析原因。

答案不相同。

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。

2PCR反应过程1PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗若需要，则与细胞内DNA复制有何区别答案PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。

由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。

2PCR的每次循环中应如何控制温度请分析原因。

答案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。

3结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的答案DNA的羟基OH末端为3端；磷酸基团的末端为5端。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。

归纳总结

PCR扩增与DNA复制的异同项目DNA复制PCR扩增不同点时期有丝分裂间期或减数

第一次分裂的间期任何时期场所活细胞内细胞外酶解旋酶.DNA聚合酶耐高温的TaqDNA聚合酶引物有转录，产生RNA作引物，无需人工加入无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物特点边解旋边复制先全部解旋后开始复制缓冲液不需缓冲液配制缓冲液代替细胞核液设备无控制温度变化的温控设备相同点原理严格遵循碱基互补配对原则引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物模板DNA的两条链为模板特点半保留复制原料游离的四种脱氧核苷酸1下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是ADNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链BDNA复制不需要引物C引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合DPCR扩增的对象是氨基酸序列答案C解析DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链；引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸序列。

2PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题1体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是。

2此过程需要一种TaqDNA聚合酶。

该酶是从中分离的。

3与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶具有的特性是。

4与体内DNA复制相比较，PCR反应要在中才能进行，并且要严格控制条件。

5PCR中加入的引物有种，加入引物的作用是。

答案1DNA的热变性原理2水生耐热细菌Taq3耐高温4一定的缓冲溶液温度52作为DNA复制的起点解析1PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。

2TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。

3与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶在90以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。

4PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。

5PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。

PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

一题多变细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗若需要，是如何实现的答案需要。

细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。

易错提醒与PCR原理有关的三个易错点1酶的作用位点解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。

不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。

2DNA聚合酶和DNA连接酶DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

3PCR中的解旋过程PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。

二.目的

二.目的DNA片段的体外扩增与鉴定片段的体外扩增与鉴定1DNA片段的PCR扩增1准备器材PCR仪.台式高速离心机.0.2mLPCR微量离心管.自动取液器.模板DNA等。

2在0.2mL微量离心管中加入5L10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5L,1L模板DNA,5L引物1和5L引物2,29L双蒸水。

3煮沸5min之后冰浴2min，低速离心，按照1单位/L加入TaqDNA聚合酶。

4扩增DNA片段的反应程序将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。

在94的条件下预热5min，再设置反应程序为94，30s55，30s72，1min以上过程循环30次。

最后一次延伸条件为72，1min。

5按照PCR仪操作要求运行反应程序。

2DNA分子的测定1配制二苯胺试剂分别配制A液

1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入

1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存和B液体积分数为0.2的乙醛溶液。

将0.1mLB液加入10mLA液中，混匀。

2条件取一定量扩增前和扩增后的溶液分别加入等量的二苯胺试剂，混匀后观察颜色变化。

用沸水浴加热上述溶液。

3现象出现蓝色现象。

3定量分析方法如果需要进行定量分析，可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法。

前者需要使用紫外分光光度计，后者需要使用电泳仪等。

1实验过程分析1离心的目的是什么在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严答案离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。

微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

2在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。

3PCR实验中使用的微量离心管.取液器.缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作还有哪些操作与此目的相同答案为避免外源DNA等的污染。

在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换。

2结果检测1实验中为什么要测定DNA的含量答案实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

2如何判断DNA扩增成功答案可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

3PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果答案样品产物少，或产生新的DNA。

3进行PCR反应的具体实验操作顺序应为设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部ABCD答案C解析PCR反应的操作步骤一般分为准备包括配制配方及将各配方放于实验台上移液混合离心反应。

PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。

4近20年来，PCR技术多聚酶链式反应成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制如图，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

1加热使DNA双链间的键完全打开，称为；而在细胞中是在酶的作用下进行的。

2如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入种特定的引物。

当温度降低至55时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是。

3PCR技术的必需条件，除了模板.原料.酶之外，至少还有三个条件，即液体环境.适宜的和，前者由自动调控，后者则靠来维持。

4通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是。

答案1氢解旋解旋2两3从子链的5端向3端延伸3温度酸碱度PCR仪缓冲液48解析1PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。

2PCR分为三个基本反应步骤变性94.退火55.延伸72，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。

由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。

3PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板.原料.酶以外，至少还需要液体环境稳定的缓冲溶液，每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等。

4一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为8。

1PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶具有耐热性D快速.高效.灵活.易于操作答案D解析PCR技术最突出的优点是快速.高效.灵活和易于操作。

TaqDNA聚合酶具有耐热性是实验操作成功的关键。

2符合PCR反应条件的一项是稳定的缓冲液环境DNA模板合成引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA解旋酶限制酶温控设备ABCD答案D解析PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶可热变性，也不需要基因工程的工具酶限制酶。

3下列关于PCR的描述中，正确的是PCR是一种酶促反应引物决定了扩增的特异性扩增DNA利用了热变性的原理扩增的对象是氨基酸序列ABCD答案D解析PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。

4如图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物A

第一次循环B第二次循环C第三次循环D第四次循环答案A解析在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从

第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。

5多聚酶链式反应PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

请回答下列问题1DNA的两条链是反向平行的，通常将的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的开始延伸DNA链。

2PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。

到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到，它的发现和应用解决了上述问题。

要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫。

3PCR的每次循环可以分为三步。

假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有个这样的DNA片段。

4简述PCR技术的主要应用要求至少答两项。

答案1磷酸基团3端2耐高温的TaqDNA聚合酶选择培养基3变性.退火和延伸324遗传疾病的诊断.刑侦破案.古生物学.基因克隆和DNA序列测定等解析一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3端，含磷酸基团的一端是5端。

引物的5端与模板链的3端结合，然后沿着引物的3端延伸。

耐高温的TaqDNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。

PCR一次循环要经历变性.退火和延伸三个阶段。