级生产实习报告.docx
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级生产实习报告
生产实习报告
2010—2011学年第二学期
姓名:
学号:
专业班级:
生物工程08级
(1)班
实习时间:
指导教师:
实习单位:
农业科学院蚕业与农产品加工研究所实习报告
1前言
我于农业科学院蚕业与农产品加工研究所粮油加工实验室进行为期两个星期的实习,主要学习如何从大米中提取酚类物质及研究大米抗氧化活性变化。
多酚是一种植物单宁(Vegetabletannins),又称植物多酚(PlantPolyphenol)是一类广泛存在于植物的皮、根、叶、果中的多元酚化合物,含量可达20%。
植物单宁是植物的次生代谢产物,属于天然有机化合物,赋予植物酸、甜、苦、涩的味道,有助于植物防御病原、害虫等危害。
尽管多酚广泛存在于植物性食物中,但是植物中多酚的含量受诸多因素影响,如成熟程度,品种、加工过程及储存条件等。
多酚类化合物的提取分离方法多种多样,我们的实验是用有机溶剂提取多酚,利用高效液相色谱法进行检测分析大米中的物质,并用福林比色法测定大米中多酚的含量。
冷冻是一种常用的有效保藏手段,以冷冻状态的大米粉为原料进行多酚的提取,则可避免原料稳定性的问题。
有机溶剂提取法不需要特殊的仪器,但存在产品安全性低、耗时长、提取率低等缺点。
且不同的有机溶剂的提取效果不同,故同一个样品我们用了不同的有机溶剂提取,通过比较吸光度确定最佳的提取方法。
1.1实习目的
在实习过程中,提高动手能力和思考能力,通过实习单位加深对本专业的就业方向的了解。
1.2实习地点:
广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
1.3实习时间:
2011年6月20日——2011年7月1日
1.4实习安排
1、开实习动员大会
2、到实习单位进行实习
3、实习总结与交流
2实习内容——大米中酚类物质含量及抗氧化活性变化研究
2.1从米中提取多酚的原理
采用Folin-Ciocalteu法测定大米中总多酚含量,其反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原,生成蓝色的化合物,颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关,在波长760nm左右有最大吸收。
2.2仪器
1、砻米机
2、XS-02100克多功能粉碎机
3、测湿度机
4、精密天平
5、均质机:
XHF-D高效分散器10r/s均质5min
6、4
400g离心机:
4000r/min
7、SB-1100旋蒸仪
8、1ml无菌注射器
9、UV-1800紫外可见分光光度计
10、恒温振荡器
11、液相色谱仪
12、移液枪(20-200ul、100-1000ul、1000-5000ul)
2.3稻米发芽过程中酚类物质含量及抗氧化活性变化研究
2.3.1样品:
稻米、糙米
2.3.2发芽工艺流程
1、稻米砻米筛选清洗消毒浸泡发芽(芽长1mm-2mm)真空干燥
2、对照试验:
稻米和糙米均使用未浸水样品,浸水后直接干燥,发芽开始后8h、16h、24h、32h四个时间点取样
2.3.3测量指标
a、稻米发芽势
在被测糙米中随机抽取四份样品,每份100粒,将糙米用无菌水冲洗后,置于20度无菌水中浸泡8h,然后将糙米排列在滤纸发芽床上,放入30度得消毒发芽箱内,相对湿度90%,糙米的发芽势测定时间为26h,对发芽的糙米进行计数,结果计算公式如下:
b、发芽过程中6个取样点稻米吸水率以及水分含量
c、发芽过程中6个取样的多酚含量、抗氧化活性及其组分变化
2.3.4操作要点
1、首先预实验确定发芽浸泡过程中稻米的吸水率,根据吸水率在后来浸泡过程中确定加水量。
2、筛选:
糙米过筛,除杂后选取大小均一致的糙米。
3、清洗:
用自来水冲洗三遍,洗去表面的糠粉和灰尘,沥干。
4、消毒:
用1%的次氯酸钠消毒5min,再用无菌水清洗糙米。
5、发芽:
将稻米、糙米(各15g)均匀摊放于经消毒的培养皿中,盖上已消毒纱布,喷洒无菌水,置于30度恒温培养箱内培养32h,湿度90%。
6、真空干燥:
发芽结束后,将发芽稻米、发芽糙米放入烘箱真空60烘干。
2.4从大米中提取游离酚的方法
2.4.1样品预处理:
稻谷风干至水分降至约13%,室温下贮藏3个月,去壳,碾磨至米糠约为10%,过40目筛,冷冻贮藏备用。
2.4.2测样品湿度
2.4.3实验步骤
方法一:
ZS和ACC米糠粉各2g加入50ml80%丙酮,冰浴上均质5mins天平平衡后离心4000r/min10min重复提取1次合并两次上清液45
旋蒸至无水状态转移收集的提取液至10ml容量瓶,蒸馏水定容移1ml至‘1.5ml离心管’,备2管,8ml至‘15ml离心管’,
冷冻贮藏备用。
方法二:
2gACC米糠粉,用50ml冷冻酸性甲醇提取,旋蒸后用蒸馏水定容至10ml,实验过程如同方法一。
方法三:
2g未发芽大米米糠粉,用50ml冷冻酸性甲醇提取,旋蒸后用冷冻酸性甲醇定容至10ml,实验过程如同方法一。
方法四:
2g未发芽大米米糠粉、发芽17h、35h、47h稻米米糠粉,用50ml80%乙醇提取,旋蒸后用蒸馏水定容至10ml,实验过程如同方法一。
方法五:
2g未发芽大米米糠粉、发芽17h、35h、47h稻米米糠粉,用50ml80%乙醇提取,旋蒸后用甲醇定容至10ml,实验过程如同方法一。
2.4.4大米中游离酚的测定——福林酚比色法
2.4.4.1原理:
在碱性条件下,酚类将钼酸还原,生成蓝色物质。
2.4.4.2实验方法
1、0.125ml稀释提取液+0.5ml去离子水+福林酚0.125ml混匀(震荡机震匀),避光反应6min。
2、反应完后在加入1.250ml7%
+1ml蒸馏水混匀避光反应90min。
3、以蒸馏水代替样品照以上步骤做空白对照。
3、在760nm下紫外分光光度计测吸光度。
2.5大米中结合酚的提取
游离酚的提取余渣+20ml2M
,室温下充入
,振荡消化1h4ml浓HCl中和加入正己烷除去脂质乙酸乙酯萃取5次乙酸乙酯全部合并,旋干酸性甲醇复溶结合酚
冷冻贮藏备用。
2.6液相色谱分析
通过查阅大量的资料,以大米中确定存在的各物质作为标准品,先用标准品跑出一个液相图,然后再跑出样品图,通过标准图和样品图的对比,排除标准品的峰后剩下的就是多酚的峰,从而确定多酚的峰值和出峰时间。
3实验注意事项
3.1游离酚提取注意事项
1、有机溶剂易挥发,使用前要冷冻,在均质等过程要冰浴。
2、样品不进行下一步骤时应放入层析柜保存。
3、通风橱操作。
4、离心前要平衡两个离心管。
5、旋蒸时,先抽真空,低转速下开始再慢慢提高转速,防止暴沸。
待丙酮提取的差不多再升温提水,直至提取剂和水分旋干。
6、旋蒸过程中若冒泡,则需放气,防止样品倒吸。
7、样品测量前要测相对湿度。
3.2福林比色法测游离酚含量注意事项
1、取样前要经过离心和膜过滤。
2、避光反应。
3、每次反应前要用仪器振匀。
3.3结合酚的提取注意事项
1、除脂。
脂在乙酸乙酯中的溶解度较大,影响结合酚的萃取。
2、若存在脂类,使萃取液分层不明显,可离心处理。
离心后,取上清液,除去中间脂层,最下层的溶液再进行萃取。
3、脂类影响会后面的分析,所以要保证萃取液不含脂类。
3.4液相色谱分析注意事项
1、在跑液相前要排气泡。
2、流动相为乙腈和冰乙酸。
4实验结果
4.1糙米培养后的生长情况
表1稻米的发芽情况
培养时间
发芽情况
6月21日上午10:
00
放入培养箱培养
6月21日晚上
逐渐吸水,无明显变化
6月22日培养17h
芽部、根部露尖尖角
培养20h
根部开始萌发
培养25h
05mm,芽长0.1-0.2mm
培养30h
根长2-3mm,芽长05-1mm
培养35h
根长5-6mm,芽长1-2mm
4.2游离酚提取后紫外分光光度计分析结果
因为实验样品数繁多,故只测出方法一中样品的吸光值,大部分样品未来得及测出吸光值。
表2方法一中ZS和ACC样的吸光值A
样品
ZS
ACC
吸光值(A)
0.7430
1.7092
因ACC样吸光值大于1,故要稀释后再测吸光值。
表3ACC稀释后的吸光值A
ACC稀释4倍的吸光值(A)
1.0796
ACC稀释6倍的吸光值(A)
1.0368
ACC样稀释4倍和稀释6倍后的吸光值略大于1,且两者相差不大,可能是样品液中有浑浊去影响分析,故稀释后的样品过膜后再测吸光值。
表4ACC稀释后经膜过滤后的吸光值A
ACC稀释4倍的吸光值(A)
0.9041
ACC稀释6倍的吸光值(A)
0.8835
4.3液相色谱分析结果
图1香豆酸标准品HPLC图谱
图2阿魏酸标准品HPLC图谱
图3稻米提取物HPLC图谱
通过对比稻米提取物的HPLC图与香豆酸标准品HPLC图谱、阿魏酸标准品HPLC图谱,出峰时间和峰值都有一定的重合性,故确定稻米提取物HPLC图谱中26-27min间的出峰物质是香豆酸,29-30min间的出峰物质是阿魏酸。
在2-4min间和47-48min间各有一个峰,暂时还找不到是哪个物质的,推测是大米中的多酚等抗氧化物质。
5实验讨论
植物总多酚常用的含量测定方法有Folin-Cio-calteu法,酒石酸亚铁法,普鲁士蓝法和高锰酸钾法等。
其中,Folin-Ciocalteu法具有操作简单,效率高,设备要求低,显色明显,精密度高,稳定性和重现性好,回收率高等优点。
本试验采用该方法测定总多酚时,溶液体系均一,工作曲线线性良好,故选用Folin-Ciocalteu法。
到实习结束为止我们都没有进行游离酚含量的测定,故无法确定哪个实验方案更能完全提取游离酚。
也没有进行结合酚含量的测定,只是把结合酚萃取出来,
冷冻贮藏备用。
但在实验过程中发现20ml的2M
不能完全提取结合酚,故改用50ml的2M
消化一小时后加入10ml的浓HCl。
但加入50ml的2M
,萃取时不易分层,可能是
加太多,可离心处理加速分层。
离心后溶液分为三层,上层为萃取出来的结合酚,中间一层为固体,最底下一层为未萃取完的溶液。
开始,我们认为中间一层固体为脂类,是正己烷去脂不完全造成的,在重复萃取之前会把中间一层固体除去。
但实验后发现萃取出来的结合酚比正常量要少,样品中大部分的结合酚都没有提取出来,且无论上一次萃取是否把中间一层固体捞干净,下一次萃取离心后,都会分三层,只不过随着萃取的次数增加,中间一层固体厚度逐渐变薄。
所以我们推测这一层固体并非是脂类,而是淀粉类物质凝结形成,其中可能含有结合酚。
我们用同样的试剂、同样的方法去提取同一样品的结合酚,加入萃取剂离心后,吸出上清液,然后把固体打碎使其与底层溶液彻底混匀,再进行下一次的萃取。
在此过程中我们发现第一次和第二次萃取离心后中间一层固体的厚度并无减小,第三次萃取离心后中间一层固体厚度明显较小,继续萃取离心,中间一层固体厚度越来越薄。
它证明了我们的推测,中间一层固体并非脂类,而是含有结合酚的物质,每萃取一次,结合酚的含量就越少,中间一层固体就会越薄,结合酚萃取就越完全。
如下图,每一次离心后中间一层固体厚度都较小。
图4第一次(左)和第二次(右)萃取离心后溶液分三层
图5第三次(左)和第四次(右)萃取离心后的溶液
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