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基因工程
基因工程
1.基因工程的诞生:
1909年,丹麦遗传学家W.Johannsen首先使用“基因”一词。
1)基因工程的三大理论基础:
①1944年美国微生物学家Avery通过肺炎链球菌对小鼠的感染实验,证明DNA是遗传信息的载体。
②1953.DNA双螺旋模型——DoubleHelix。
③从1958年起,Meselson和Stahl提出了DNA的半保留复制,Crick等提出中心法则以及遗传密码等。
1966年,美国科学家Nirenberg等人破译了全部的DNA遗传密码,1969年与Holley和Khorana分享了诺贝尔生理医学奖。
2)基因工程的三大技术源泉:
①1970年Smith、Qilcox及Kelley分离到第一种可以在DNA特定位点将DNA分子切开的限制性核酸内切酶。
②同年,美国的Temin和Baltimore发现RNA肿瘤病毒中存在逆转录酶,他们于1975年共享诺贝尔生理学奖。
③1972年,Berg、Boyer等人第一次成功地完成了DNA重组实验。
1975-1977年,美国人Sanger和Gilbert发明了快速DNA序列测定技术,并于1977年完成了噬菌体ΦX174基因组(5386bp)的序列测定。
1980年Sanger和Gilbert与Berg分享了诺贝尔化学奖。
1986年,Mullis发明了PCR技术。
1993年Mullis与第一个设计定点突变的Smith共享了诺贝尔化学奖。
1988年Waston出任“人类基因组计划”首席科学家,举世瞩目的人类基因组测序工作开始启动
2000年6月26日,人类基因组工作框架图绘制完成
2.基因工程的研究内容:
特定目的基因的分离与合成;构建重组DNA分子;转化宿主细胞;筛选重组DNA菌落;目的基因的有效表达。
(掌握)3.基因工程的流程:
(补字,见书8)
4.基因工程应用:
(仅仅了解)
(1)基因工程在工业领域的应用;
(2)基因工程与农业;(3)基因工程在医药领域的应用:
基因治疗,基因诊断,基因克隆在生物制药中的应用。
5.核酸的理化性质及其应用:
⑴增色效应:
核酸260最大,蛋白质280最大
⑵DNA的变性:
⑶DNA的复性与杂交:
⑷DNA的定量与DNA纯度判断:
在核酸的紫外吸收中,消光系数常用浓度mg/mL表示,1mg/mL的dsDNA的A260值为20,相应地,ssDNA和RNA的A260值为25。
dsDNA的大致纯度可以由A260/A280来确定。
与消光系数相同,光吸收谱的形状也会随着碱基的环境变化而变化。
纯dsDNA的A260/A280值为1.8,纯RNA的A260/A280值为2.0,而蛋白质由于λmax=280nm,A260/A280值小于1(实际上在0.5左右)。
所以,如果DNA样品的A260/A280值大于1.8,说明样品受RNA污染;如果其A260/A280值小于1.8,则说明样品受蛋白质污染。
6.质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位.
⑴接合型质粒(conjugativeplasmid):
含有一套控制细胞配对和质粒接合转移的基因,指令宿主细胞合成一系列细胞表面物质,促进宿主细胞与受体细胞结合,导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞中。
分子较大,拷贝数较少,宿主广。
(non-conjugativeplasmid)非接合型恰好相反。
⑵严紧型质粒(stringentplasmid):
每个宿主细胞中所含拷贝数为1-2个,多为大质粒;松弛型质粒(relaxedplasmid):
拷贝数10-60,多为小质粒,构建的质粒克隆载体为该质粒。
(未完)7.①原核基因表达调控:
②真核基因表达调控:
8.⑴名解:
①外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化(transformation);
②以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染(transfection);
③利用载体(噬菌体或病毒)把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导(transduction);
④一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位(transposition),这些游动的基因叫转位子。
⑵同源重组即交换(Crossover):
依赖于大范围的DNA同源序列的联会,在重组过程中,两条染色体或DNA分子相互交换对等的部分。
真核生物的非姊妹染色单体的交换、细菌以及某些低等真核生物的转化、细菌的转导接合、噬菌体的重组等都属于这种类型。
同源重组的分子机制:
Holliday模型。
最重要作用:
基因打靶技术。
9.基因工程实验中常用的工具酶及功能:
Ⅱ型限制性核酸内切酶:
在特异性的碱基序列部位切割DNA分子。
DNA连接酶:
将两条DNA分子或片段连接成一个整体。
DNA聚合酶Ⅰ:
通过向3,端逐一加核苷酸的方式填补双链DNA分子上的单链缺口。
反转录酶:
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
多核苷酸激酶:
把一个磷酸分子加到多核苷酸的5,-OH端
末端转移酶:
将同聚物尾巴加到线性双链DNA分子或单链DNA分子的3,-OH末端
碱性磷酸酶:
催化从DNA分子的5,端或3,端或同时5,和3,端移去末端磷酸
SI核酸酶:
催化RNA和单链DNA分子降解成5,单核苷酸,同时也可切割双链核酸分子的单链区
TaqDNA聚合酶:
能在高温(72度)下以单链DNA为模板合成新生互补链
10.⑴细菌的限制-修饰系统(P50)
⑵限制酶的命名:
是采用Smith和Athens提议的方案,即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母,大写;第2,3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母,小写;如果它的来源菌还有株系,则有第4个字母;最后用大写罗马数字,代表同一菌株中不同限制酶的编号。
前三个字母用斜体表示。
(3)限制性核酸内切酶的分类:
根据其识别和切割序列的特性等,限制酶分为I,Ⅱ,Ⅲ三大类。
I类:
不适用于基因工程。
只在肠道菌中发现。
Ⅱ类:
基因工程的工具酶。
Ⅲ类:
切割位点不在识别位点,一般离识别位点25bp~27bp,对分子克隆操作亦无实用意义。
(未具体说明为第二个)
(4)回文序列(palindrome):
从两“侧”读核苷酸顺序都是一样的序列。
限制性内切酶的识别序列特征及其切割方式:
(P53)
①EcoRⅠ的识别序列:
;切割方式:
②HaeⅠ的识别序列:
;切割方式:
限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算:
(P55)
(5)影响限制性内切酶酶活的因素:
1)DNA的纯度;2)DNA甲基化程度;3)DNA分子结构;4)限制性内切酶的缓冲液:
BSA:
牛血清蛋白,作用:
维持限制性内切酶的稳定性。
11.常用DNA连接酶有:
大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。
两者对于限制酶切割后产生的互补粘性末端的连接十分有效,但是对于双链DNA片段的平末端的连接效率很低,而且只能用T4DNA连接酶,大肠杆菌DNA连接酶不能催化平末端的连接。
12。
DNA聚合酶:
⑴大肠杆菌DNA聚合酶I:
a活性分类:
①5′→3′聚合活性:
2、DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合,只能在一段寡核苷酸的3-OH逐个添加脱氧核苷酸,使核苷酸链不断延长。
②核酸外切酶活性:
b应用:
1)切口移位法标记DNA
在DNase的作用基础上产生链内切口,应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步联合反应,使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。
若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α32P,就能使生成的双链带有标记物。
2)3’-粘端的末端标记
先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性,切除凸出的3’-粘端,形成5’-凸出粘端;再以其5’→3’聚合酶活性使其补平,在高浓度的dNTP条件下,使3’-端的外切反应与dNTP的搀人反应达到平衡。
若dNTP中有放射性标记的核苷酸,即可使产物成为3’-末端带标记的DNA。
3)合成cDNA的第二链
⑵Klenow片段:
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经过枯草芽孢杆菌蛋白酶的处理得到大小不同的两个片段中的大片段。
Klenow酶用途:
1.随机引物标记核酸探针;2.5’-粘端补平或3’端标记;3.合成cDNA的第二链;4.DNA序列分析;5.3’-端的末端标记。
(3)T4DNA聚合酶(4)T7DNA聚合酶(5)反转录酶:
构建文库(6)TaqDNA聚合酶
13.其他DNA修饰酶:
(1)碱性磷酸酶:
作用:
在用32P标记DNA的5,末端前,除去5,端磷酸;在DNA重组过程中,除去DNA片段5.-磷酸以阻止其自身环化。
(2)核酸酶,(3)S1核酸酶,(4)DNA酶,(5)RNA酶,(T4多聚核苷酸激酶):
用于探针的末端同位素标记。
(6)末端脱氧核苷酸转移酶;来源:
前淋巴细胞和分化早期的类淋巴样细胞。
在二价阳离子的存在下,该酶能够逐个的将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3,-OH末端。
反应不需要模板存在。
是非特异性酶,四种dNTP均可作为底物。
用途:
分别给外源DNA片段和载体分子加上互补的同聚物尾巴,使它们可以连接起来。
14.探针(probe):
一段带有检测标记的与目的DNA特异互补的已知核苷酸序列
探针的标记策略:
常用酶促标记技术:
(1)切口平移法标记(2)DNA快速末端标记(3)随机引物延伸
15.什么是碱裂解法:
首先用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,然后加入溶菌酶裂解细菌细胞壁;再于体系中加NaOH和SDS的混合溶液,去膜释放内含物;同时用高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体,这样就去除了染色体DNA及大部分蛋白质(用NH4Ac和LiCl同步沉淀蛋白质和RNA有良好的效果,胜过单用其中一种);最后离心取上清液,用苯酚-氯仿萃取,去除痕量的蛋白质,再用乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,进一步用无DNase的RNase去除残余的DNA即可。
16.电泳(EP):
将某种带电分子置于特定的电场中,他就会以一定的速度向适当的电极移动,这就是电泳。
①原理:
某物质在电场作用下的迁移速度叫电泳的速率,它与电场强度和分子本身所携带的净电荷数成正比,而与分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,故DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态(polyanion)。
若将DNA,RNA放到电场中,它就会由负极向正极移动。
由于核糖-磷酸骨架结构上的重复性质,核苷酸数目相同的双链DNA分子几乎具有等量的净电荷,因此它们能以相同的速度向正电极方向移动。
在凝胶电泳中,一般加入EtBr进行染色。
因为扁平状的EtBr分子可以嵌入DNA或RNA相邻碱基平面之间,且该分子在300nm紫外光激发下能够发出橘黄色荧光。
染色后可通过对荧光的分析而对分子所形成的条带进行定性或定量分析。
②琼脂糖凝胶电泳用途:
分离大分子DNA(小于20kb)。
脉冲场电泳(PFGE):
可分离更大片段的DNA(大于50kb,甚至10Mb)
17.分子杂交技术:
Southernblotting(southern印记杂交):
检测DNA
Northernblotting(northern印记杂交):
检测RNA
Westernblotting(western印记杂交):
检测蛋白质(免疫反应)。
(最重要)18.聚合酶链式反应PCR:
能够特异的扩增任何希望的目的基因或DNA片段。
原理(画图回答):
变性,退火,延伸,循环。
主要成分:
①DNA模板②引物③底物dNTP④耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)⑤PCR缓冲液⑥MgCl2⑦其余不足的空缺体积用ddH2O补齐。
条件:
94度预变性5min,94度变性30s,55度退火30s,72度延伸1min,在25-30个循环后于72度保温10min,然后使反应在4度下停止。
应用:
①大量扩增目的基因或DNA片段②传染病检测③DNA的重组与筛选④基因定点突变
原理
19.基因文库:
(genelibrary)指在一种载体群体中,随机的收集着某一生物DNA的各种克隆片段,理想地包含着该物种的全部遗传信息。
基因文库分为基因组文库,cDNA文库等。
基因文库的构建的基本程序:
①DNA④提取及片段化,或是cDNA的合成②载体的选择及制备③DNA片段或cDNA与载体连接④重组体转化宿主细胞⑤转化细胞的筛选。
基因文库筛选基因的策略:
DNA与蛋白质相互作用研究策略:
凝胶阻滞试验(EMSA);DNaseⅠ足迹法。
蛋白质与蛋白质相互作用研究策略:
酵母双杂交技术;噬菌体表面呈现技术,分离的泛素系统,分子对接计算机模拟法。
20.载体的三大要素:
复制起点:
(Ori);外源基因的插入点或限制性内切酶的酶切位点(MCS);选择性的遗传标记Amp(上标)r(A),Tet(上标)r(T)。
1)质粒:
本质是细菌染色体以外的遗传物质,是一种简单的,环状DNA分子,能自主复制。
构建质粒克隆载体的基本策略:
(1)去掉非必需的DNA区域。
(2)减少限制性内切酶的酶切位点的数目
(3)加入易于检出的选择性标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞。
(4)关于质粒安全性能的改造。
(5)改造或增加表达基因的调控序列。
质粒克隆载体的构建:
pBR322;pUC18/pUC19;pUC衍生质粒载体:
pGEM-3Z和pGEM-4Z,pSP64和pSP65。
2)λ噬菌体(λbacteriophage):
一类细菌病毒总称,有遗传物质核酸和其外壳蛋白组成。
λ噬菌体基因结构:
见下面两个图;
Cos位点(Cohesive-endsite):
λDNA为线状双链分子,两端各有12个碱基的单链互补粘性末端,通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。
这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。
λ噬菌体载体的类型:
插入型载体;替换型载体(书图5-6P103)
3).cosmid克隆载体:
及λ噬菌体和质粒相结合的杂合载体。
4).大分子DNA克隆载体:
细菌人工染色体BAC:
建立在E.coli的F因子基础上的载体系统,F因子又称为F质粒,是一种“性质粒”。
BAC载体只有7.4kb,但保留了F因子的自主复制,拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因,如OriS,RepE,parA,parB,parC。
酵母人工染色体YAC:
在酵母细胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆载体。
YAC是用人工方法由酵母染色体中不可缺少的主要片段组建而成的。
这些片段包括染色体末端的端粒(TEL),中间的着丝粒(CEN),酵母ARS序列和酵母选择标记。
以上四种载体总结:
容量范围:
质粒载体10kb;λ噬菌体载体17-24kb;cosmid克隆载体(柯斯质粒或黏粒):
45kb;人工染色体:
200kb。
(选择)
5)基因打靶载体(genetargetingvector):
特点:
同源重组。
用途:
进行定向转基因;研究一个基因的功能。
21.1)目的基因的化学合成:
用途:
主要用于合成较小的基因、寡聚核苷酸杂交探针、PCR扩增的引物和连接用的各种接头。
2)PCR扩增获得目的基因:
(1)目的基因的直接克隆(直接从基因组中扩增):
提取基因组DNA作模板;根据目的基因序列设计引物;PCR扩增。
扩增原核基因。
(2)目的基因的间接克隆(从mRNA中扩增):
RT-PCR(重点):
(一)已知基因序列的RT-PCR(重点):
①提取基因组totalRNA;②反转录合成总cDNA作模板;③根据目的基因序列设计引物;④PCR扩增。
扩增真核基因。
反转录(RT):
反转录是以RNA为模板合成DNA的过程,也称逆转录。
反转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)可在引物端添加酶切位点
PCR引物设计的原则:
1、引物的长度,一般为15-30;2、引物的序列:
在模板内应当没有相似性;3、引物3’末端:
3’端不能用碱基A;4、引物的GC含量:
一般为40-60%5、退火温度:
退火温度比解链温度低5度;6、△G值:
3’端△G值应较低;7、避免为下一步操作而产生的不完全匹配。
已知目的基因序列的扩增RT-PCR扩增:
(二)已知目的基因编码N端部分序列的RT-PCR过程
3)构建基因文库获取目的基因:
①基因组文库的构建:
;②cDNA文库的构建:
22.基因的体外重组与转化:
1)DNA片段的体外连接:
分类:
黏末端连接;平末端连接;修饰黏末端连接
(1)黏性末端连接:
防止载体自连:
方法一:
调整连接反应体系中两种DNA的浓度以及比值。
方法二:
先用碱性磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶CIP)对线性的载体DNA进行处理,去除线状DNA分子两末端的5,磷酸基团。
(2)平(齐)末端(bluntend)连接:
要点:
T4DNA连接酶连接;外源DNA片段插入没有方向性,重组体连接方式复杂;效率低,酶用量大。
(注:
T4噬菌体DNA连接酶可连粘性末端金额平齐末端,而大肠杆菌只能连粘性末端)。
(3)PCR产物的连接:
T/A克隆最常用。
另外还有将PCR产物的末端抹平;在引物的5’端设计酶切位点。
2)(了解)DNA体外连接应注意的事项(书P152)
3)重组体导入细胞:
(1)感受态细胞(competentcell):
细胞通透性发生了暂时性的改变,成为了容易接受外源DNA分子进入的感受态细胞。
制备原理:
用CaCl2处理大肠杆菌,能增加膜的通透性。
制备过程:
23.利用载体提供的表型特征筛选重组体:
原理:
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:
Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。
1)插入失活:
外源DNA片段(不能太小)插入载体的标记基因序列中,导致该基因结构被破坏而失活,使转化细胞失去该基因的表型。
(如下左图)
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活,可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
2)蓝白班筛选法:
利用lacZ基因表达的β-半乳糖苷酶催化显色底物为标记,以呈现颜色来提供选择信息。
如果Ampr上插入外源DNA,导致氨苄青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素指示液选择。
(如上右图)24.DNA电泳检测法:
(会分析图,仔细看书P65)
25.PCR扩增检测法
原理:
PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
过程:
①从重组克隆中提取质粒(或DNA)。
②用外源DNA插入片断引物作PCR。
③电泳PCR产物。
④检查是否有PCR产物。
⑤PCR产物的长度是否与外源基因一致。
26.原位杂交(insituhybridization):
该技术是生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑通过硝酸纤维素滤膜覆盖其表面,使菌落或噬菌斑按照原来生长的位置不变的转移到滤膜上,然后在滤膜的原位发生溶菌,DNA变性和杂交作用,所以此种菌落杂交或噬菌斑杂交也称为-。
27.免疫化学检测法:
本质:
对表达产物的检测。
蛋白——蛋白“杂交。
利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
28.(判断)五种方法的检测对象:
Southern:
DNA;(酶联免疫吸附剂ELISA)Northern:
RNA;Western:
蛋白质;核酸电泳检测:
DNA;PCR检测:
DNA;酶联免疫吸附剂ELISA:
DNA
哪种检测法直接告诉基因已表达:
W,N。
29.绿色萤光蛋白:
(GFP)其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。
在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reportergene)。
一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:
兔子上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法。
30.在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(InclusionBodies,IB)。
31.穿梭载体(shuttlevector)是指能够在两类不同宿主细胞中复制,增殖的载体。
32.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):
分离复杂的蛋白质混合物,测蛋白质分子量。
33.计算:
①(P54)酶切片段计算:
假如用限制性内切酶EcoRI来对E.coli基因组进行酶切消化,大概可以产生多少个DNA片段?
(提示:
GAATTC处切割)
答案:
1123个DNA片段
提示:
1.大肠杆菌基因组为环状,基因组大小为4600000bp
2.EcoRI识别位点为5’-GAATTC-3’
3.六个核苷酸的排列种类4×4×4×4×4×4种(4096),其中GAATTC出现的几率为1/4096
②PCR产物:
(P76)
③基因组文库完备性:
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