分子生物学基础实验.docx
- 文档编号:11299029
- 上传时间:2023-02-26
- 格式:DOCX
- 页数:11
- 大小:23.19KB
分子生物学基础实验.docx
《分子生物学基础实验.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子生物学基础实验.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
分子生物学基础实验
分子生物学基础实验
实验一质粒DNA的小量制备
一、实验原理
载体:
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进细胞中去进行繁殖和表达,需要运载工具,携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体(vector)。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。
作为基因工程的载体必须具备下列条件:
(1)是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;
(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增;(3)载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择性的遗传标记,如有抗四环素基因(Tcr),抗新霉素基因(Ner)等,以此知道它是否已进入受体细胞,也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。
细菌质粒具备上述条件,它是基因工程中常用的载体之一。
文档收集自网络,仅用于个人学习
质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1~120kb之间,具有双链闭合环状结构的DNA分子,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。
它可独立游离在细胞质内,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
文档收集自网络,仅用于个人学习
质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:
严密控制型(stringentcontrol)和松弛控制型(relaxedcontrol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,它也不复制。
每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时复制,在细胞里,它有许多拷贝,一般在20个以上。
通常大的质粒如F因子等,拷贝数较少,复制受到严格控制。
小的质粒,如ColEⅠ质粒(含有产生大肠杆菌素E1基因),拷贝数较多,复制不受严格控制。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,染色体DNA复制受阻,而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝,此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%-50%。
质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。
文档收集自网络,仅用于个人学习
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:
培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在清液中。
用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。
文档收集自网络,仅用于个人学习
质粒DNA的相对分子量一般在106-107范围内,如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106,质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。
在细胞内,共价闭环DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA)常以超螺旋形式存在。
如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫做开环DNA(opencircularDNA,简称ocDNA)。
在电泳时,同一质粒如以cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度快,因此在本实验中,自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
文档收集自网络,仅用于个人学习
二、实验目的
1.掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。
2.了解制备原理及各种试剂的作用。
三、实验材料和试剂
材料:
大肠杆菌E.coli,质粒pegf。
试剂:
1.LB培养基:
10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/LNaCl,用NaOH调pH至7.3左右。
如固体培养基则添加15g/L琼脂。
文档收集自网络,仅用于个人学习
2.溶液Ⅰ(mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA。
灭菌后存放。
文档收集自网络,仅用于个人学习
3.溶液Ⅱ(0.2mol/LNaOH(内含1%SDS)):
预先配制1%SDS母液,临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH,4℃保存。
文档收集自网络,仅用于个人学习
4.溶液Ⅲ(pH4.8乙酸钾溶液):
5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。
文档收集自网络,仅用于个人学习
5.酚/氯仿液(V/v=1/1):
酚为重蒸酚,配制时,先将氯仿中加入异戊醇,使其体积比为24:
1,然后等量的加入重蒸酚,混匀,并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物,于棕色瓶中存放,并在上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6),4℃保存。
文档收集自网络,仅用于个人学习
6.无水乙醇
7.70%乙醇
8.pH8.0TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA,其中含RNA酶20μg/mL。
文档收集自网络,仅用于个人学习
仪器:
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL~lmL)、吸头。
文档收集自网络,仅用于个人学习
四、操作步骤
(一)培养细菌
将带有质粒pegf的大肠杆菌接种在含50μg/mL卡那霉素(Ka+)的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
注意:
添加Ka+时,须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。
文档收集自网络,仅用于个人学习
(二)从菌落中快速提取制备质粒DNA
1.取1.5mL(750uL取两次)菌液置于1.5mLEp管中,10000rpm离心3min。
2.弃上清,重复步骤1,弃上清,加入150μLGET缓冲液,在涡旋混合器上充分混匀。
3.加入300μL新配制的0.2mol/LNaOH(内含1%SDS),加盖,颠倒(不要振荡)3次,使之混匀。
文档收集自网络,仅用于个人学习
4.加入225μL冰冷的乙酸钾溶液。
加盖后,颠倒(不要振荡)3次使之混匀。
5.10000rpm离心5min,上清液吸至另一干净的1.5mLEp中,如上清液浑浊则需重新离心一次。
文档收集自网络,仅用于个人学习
6.于上清液中加等体积氯仿,振荡混匀,10000rpm离心5min,小心吸取上清液,转移至另一支1.5mLEp管中,注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。
文档收集自网络,仅用于个人学习
7.向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀,用离心机于10000rpm离心5min。
小心吸去上清液。
8.用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次,10000rpm离心5min,除尽乙醇,室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上),备用。
文档收集自网络,仅用于个人学习
9.用20uLTE重新溶解DNA,置于4℃保存,供电泳使用。
贮存于-20℃备用,可长期保存。
实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定
一、实验原理
测定核酸通常采用两种方法:
即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。
1.紫外分光光度法
DNA或RNA定量时,应在260nm和280nm两个波长下读数。
根据计算在260nm波长下,每1ug/mLDNA钠盐的A值为0.20,即在A260=1时,双链DNA含量为50ug/mL,单链DNA与RNA含量为40ug/mL,单链寡核苷酸的含量为33ug/mL。
文档收集自网络,仅用于个人学习
双链DNA含量=A260×50×稀释倍数(ug/mL)
RNA含量=A260×40×稀释倍数(ug/mL)
单链DNA含量=A260×33×稀释倍数(ug/mL)
此外还可以根据260nm和280nm的读数间的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。
2.琼脂糖凝胶电泳法
根据DNA分子量不同,采用外加电场使其分开,用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。
而荧光强度正比于DNA的含量,如将已知浓度的标准样品表2-1作为电泳对照,就可以估计出待测样品的浓度。
电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照,只需要5-10ngDNA,就可以从照片上比较鉴别。
文档收集自网络,仅用于个人学习
由于电泳时所用的样品量非常少,只要将浓度控制在几十纳克即可,所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。
文档收集自网络,仅用于个人学习
表2-1λDNA/HindⅢ中DNA片断
片段
碱基对数目/kb
相对分子质量
DNA含量/%
DNA含量/(ng/mg)
1
23.130
15.0×106
47.7
476.9
2
9.419
6.12×106
19.4
194.1
3
6.557
4.26×106
13.5
135.2
4
4.371
2.84×106
9
89.9
5
2.322
1.51×106
4.8
47.9
6
2.028
1.32×106
4.2
41.8
7
0.564
0.37×106
1.1
11.6
8
0.125
0.08×106
0.3
2.6
二、实验目的
1.从以上实验中提取到的质粒DNA,为了能作下一步的酶切,连接及转化实验,必须测定DNA的纯度、含量以及分子量大小。
文档收集自网络,仅用于个人学习
2.本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳,学习检测DNA、含量与相对分子质量大小。
三、实验材料和试剂
材料:
自制的质粒DNA、λDNA/HindⅢ、。
试剂:
1.标准DNAmarker(λDNA/HindⅢ)
2.限制性内切酶HindⅢ和10X缓冲液
3.酶反应中止液:
0.25%溴酚蓝(含40%蔗糖),已配好。
4.溴化乙锭染液(EB):
使用前稀释1000倍,母液已配好。
注意:
EB是一种诱变剂,配制和使用时应戴好手套,并且不能将该染液洒在桌面或地面上!
使用后立即用大量的水冲洗干净。
文档收集自网络,仅用于个人学习
5.0.5×TBE缓冲液:
Tris2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。
可配成5×TBE母液,使用时稀释10倍即可。
文档收集自网络,仅用于个人学习
6.0.7%琼脂糖
仪器:
37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL~lmL)、吸头。
文档收集自网络,仅用于个人学习
四、实验操作
(一)质粒DNA的酶解
1.新提的质粒,在10uL的体系中用单一酶(如EcoRⅠ)进行处理,即:
质粒DNA2μL
10×缓冲液1μL
EcoRⅠ0.5μL
ddH2O6.5μL
2.37℃,保温30min。
3.加入1/10体积的酶反应终止液,混匀以停止酶解反应。
各酶解样品于冰箱中贮存备用。
(二)琼脂糖凝胶板的制备
1.琼脂糖凝胶的制备
称取1.0g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入100mLTBE缓冲液,瓶口倒扣一小烧杯,于电炉上加热,注意:
防止溢出,由于琼脂糖较难溶解,如果水分损失较大,则补充一定量的蒸馏水,使其终浓度为1%。
文档收集自网络,仅用于个人学习
2.胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干。
取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好,形成一个边脚模子。
注意:
将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上,不能留空隙。
文档收集自网络,仅用于个人学习
将有机玻璃内槽置于水平位置,放好样品槽模板(一般称之为梳子),将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶,小心地倒在内槽上,控制灌胶速度,使胶液缓慢地展开,直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置1h左右,待凝固完全后,轻轻拔出样品槽模板,撕去胶带纸,胶板上即形成相互隔开的样品槽。
文档收集自网络,仅用于个人学习
将有机玻璃内槽放入电泳槽中,加入0.5×TBE电泳缓冲液,以盖过胶板为宜。
胶板内的样品小槽
3.加样
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内,每次加完一个样品为了避免交叉污染,各样品用不同的吸头,以免造成限制酶被污染。
加样时,吸头不要插入胶板内,防止碰坏样品槽周围的凝胶面,每个样品槽的加样量不宜过多,本实验加样为10uL左右。
文档收集自网络,仅用于个人学习
4.电泳
加完样品后应立即通电,进行恒压电泳。
在低压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm。
文档收集自网络,仅用于个人学习
当溴酚蓝染料(蓝色)移动到距离胶板下沿约1~2cm处,停止电泳。
5.染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中,进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。
染色15min后,用大量水冲洗。
文档收集自网络,仅用于个人学习
6.观察
在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶。
DNA存在处显示出红色荧光条带。
用凝胶自动成像仪处理代替。
实验三感受态细胞的制备及转化
一、实验原理
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。
转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。
转化的基本原理是细胞处于0℃,CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸混合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在选择性培养基平板上培养,可选出所需的转化子。
文档收集自网络,仅用于个人学习
二、实验目的
1.学习和理解影响细胞感受态的因素,掌握感受态细胞的制备方法。
2.掌握质粒的转化方法。
把体外DNA引入受体细胞,使受体菌具有新遗传性,并从中选择出转化子。
三、实验材料和用具
材料:
自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。
试剂:
LB琼脂平板(无抗生素)、
LB琼脂平板(含50μg/L卡那霉素)、
LB液体培养基5mL(无抗生素)、
LB液体培养基100mL(无抗生素)、
LB液体培养基5mL(含50μg/L卡那霉素)、
0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。
仪器:
恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
四、操作步骤
(一)大肠杆菌感受态细胞的制备
1.从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落,接种于5mL液体培养基中,37℃振荡培养过夜,直至对数生长期。
将该菌悬液以1:
50接种于50mLLB液体培养基中,37℃快速振荡培养3~4h。
文档收集自网络,仅用于个人学习
2.取5mL培养液放入离心管中,5000rpm离心10min。
3.可用加样器将残余液体尽量去净,用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~30min。
文档收集自网络,仅用于个人学习
4.5000rpm离心10min。
5.弃上清,加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻,即制成了感受态细胞悬液。
文档收集自网络,仅用于个人学习
6.制好的感受态细胞可在冰上放置,24h内直接用于转化实验,也可加入占总体积95%左右高压灭菌过的甘油,混匀后分装于Ep管中,-70℃条件下可保存半年至一年。
文档收集自网络,仅用于个人学习
(二)细胞转化
编号
质粒
感受态细胞
无菌水
0.1mol/LCaCl2
样品/uL
2
100
/
/
对照1/uL
/
100
2
/
对照2/uL
2
/
/
100
将以上各样品轻轻摇匀,冰上放置30min后,于42℃水浴中保温90s,然后迅速在冰上冷却3~5min。
上述各管中分别加入400μLLB液体培养基,使总体积为500μL,该溶液称为转化反应原液,摇匀后于37℃振荡培养45~60min,使受体细胞恢复正常生长状态,并使转化体产生抗药性。
文档收集自网络,仅用于个人学习
(三)平板培养
取各样品培养液100μL分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培养基上(分别记为Ka+和Ka—),涂匀。
37℃培养24h,待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。
文档收集自网络,仅用于个人学习
(四)检出转化体
不含抗生素培养基
含抗生素培养基
结果分析
受体菌对照组
有大量菌落长出
无菌落长出
本实验未产生抗药性菌株
质粒对照组
无菌落长出
无菌落长出
质粒DNA不含杂菌
转化实验组
有大量菌落长出
有菌落长出
质粒进入受体菌中产生抗药性
五、注意事项
1.这一个实验中的所有操作均要为无菌操作,在超净工作台内进行。
2.细胞转化中,42℃水浴90s要准确操作。
3.制备感受态细胞过程中,需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。
六、思考题
1.质粒的基本性质有哪些?
答:
质粒主要在基因工程中用于重组质粒的构建。
所以它有以下性质:
(1)质粒能在寄主细胞中“友好”地“借居”,能够自我复制,或整合到染色体上,随染色体进行复制。
(2)有多个限制酶切点(便于进行切割)(3)有标记基因,以便于进行检验是否成功导入受体细胞。
文档收集自网络,仅用于个人学习
(2)为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置?
为达到这一目的,需要注意些什么?
答:
将质粒DNA反复在4摄氏度,-20摄氏度放置,室温中放置会导致环状的DNA的断裂成线性的分子,不能得到环状的DNA分子。
所以为了避免这一问题对于提取的DNA,因根据使用其的时间不同而作区别的处理:
对于近段时间就要用的质粒DNA因根据使用而对于长时间不用的质粒DNA,则应保存在-20摄氏度的冰箱中,因为在相对低的温度下质粒可以保存较长的时间。
文档收集自网络,仅用于个人学习
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 基础 实验