基因定点突变全攻略Word文档下载推荐.docx
- 文档编号:13457331
- 上传时间:2022-10-10
- 格式:DOCX
- 页数:11
- 大小:72.01KB
基因定点突变全攻略Word文档下载推荐.docx
《基因定点突变全攻略Word文档下载推荐.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因定点突变全攻略Word文档下载推荐.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
(1)通常引物长度为25~45bp,我们建议引物长度为30~35bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为11—12bp。
若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补得引物。
(2)如果设定得引物长度为30 bp,接下来需要计算引物得Tm值,瞧就是否达到78℃(GC含量应大于40%)。
(3)如果Tm值低于78℃,则适当改变引物得长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。
(4)设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置.
(5)最好使用经过纯化得引物。
Tm值计算公式:
Tm=0、41×
(%ofGC)–675/L+81、5
注:
L:
引物碱基数;
%ofGC:
引物GC含量.
四、引物设计实例
以GCG→ACG为例:
5'—CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
(1)首先设计30bp长得上下游引物,并将A(T)设计在引物得中央位置.
Primer#1:
5'
—CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC—3’
Primer#2:
5’—GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG—3'
(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75、5(Tm=0、41×
40-675/30+81、5)。
通过计算可以瞧出其Tm低于78℃,这样得引物就是不合适得,所以必须调整引物长度.
(3)重新调整引物长度.
Primer #1:
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'
Primer#2:
5’—CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物得GC含量为45、7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80、952(Tm=0、41×
47、5-675/35+81、5),这样得引物就可以用于突变实验了.
五、突变所用聚合酶及Buffer
引物与质粒都准备好后,当然就就是做PCR喽,不过对于PCR得酶与buffer,不能用平时得,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段得buffer,另外,要用保真性能较好得PFU酶来扩增,防止引进新得突变。
除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene与塞百盛得试剂盒,但价格昂贵。
可以使用高保真得聚合酶,如博大泰克得金牌快速taq酶、Takara得PrimeSTARTMHS DNApolymerase。
六、如何去掉PCR产物
最简单得方法就就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用得模板一般都就是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来(除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株),而PCR产物都就是没有甲基化得,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株.
DpnI处理得时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.
七、如何拿到质粒
直接把通过DpnI处理得PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A]诱导突变基因(PCR反应)以待突变得质粒为模板,用设计得引物及Muta—direct™酶进行PCR扩增反应,诱导目得基因突变.
1、 设计点突变引物.
[注]参考引物设计指导
2、准备模板质粒DNA
[注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低得现象,但就是对突变效率没有影响。
提取质粒DNA时我们建议您使用本公司得质粒提纯试剂盒。
3、[选项]对照反应体系(50μl反应体系)
10×
ReactionBuffer
5μl
pUC18controlplasmid(10ng/μl,total20ng)
2μl
Controlprimermix(20pmol/μl)
2μl
dNTPmixture(each2.5mM)
dH2O
38μl
Muta-direct™ Enzyme
1μl
4、样品反应体系(50μl反应体系)
ReactionBuffer
5μl
Sampleplasmid(10ng/μl,total20ng)
2μl
Sample primer(F)(10pmol/μl)
Sampleprimer(R)(10pmol/μl)
1μl
dNTPmixture(each 2。
5mM)
dH2O
38μl
Muta-direct™Enzyme
5、PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
Cycles
Temperature
ReactionTime
1cycle
95℃
30sec
15cycle
95℃
30sec
55℃
1min
72℃
1minperplasmid Kb
6、PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融)。
[注] 按下列提供得PCR条件进行扩增,控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低得现象。
Mutation
Cycles
1~2Nucleotide
15cycles
3Nucleotides
18cycles
[B]突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.
1、准备PCR反应产物
2、 加入1μl(10U/μl)Mutazyme™酶37℃温育1小时.
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全得现象。
因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作.如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E、coli中时请选择dam+型菌株,例如DH5α。
1、将10μl样品加到50μl感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟。
2、接下来可以参照一般得转化步骤进行.
序列分析
通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析。
先讲最简单得一个点得定点突变技术,其它较长片段得突变,删除,插入技术以后会慢慢奉上:
在做实验之前,我们首先要搞清楚实验得目得与实验得原理。
ﻫ 实验得目得应该比较明确吧:
就就是要把自己得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基。
一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做:
第一:
我们吊出来得基因有点突变,相信这可能就是大家经常会遇到得问题。
基因好不容易吊出来,并装进了自己得载体,却发现有一两个碱基跟自己得预期序列或所有得公共数据库不匹配,然后暴昏。
大家实验室里面还就是用Taq酶为主吧,Pfu这样得高保真酶大家应该用得不多吧,Taq酶得优点与缺点都很明显:
优点就就是扩增效能强,缺点就就是保真性差,其错配机率就是比较高得,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果就是2000bp得基因,如果扩四五十个循环得话,很大机率会出现点突变,当然这也跟具体PCR体系里得Buffer有很大关系,详细情况这里就不讨论了。
第二:
要研究基因得功能,在基因上自己选定位置更换碱基得保守序列,或者改造成不同得亚型,总之就就是要人工改造碱基序列符合自己得实验需要,相信这也就是那些研究基因得人经常得一种思路吧。
对于第一种情况:
我们首先要分析出现碱基不匹配得位置就是不就是重要得位置,如果不就是很重要,大可不必管它,比如说就是三联密码子得最后一位,碱基得改变并没有引起相应氨基酸得改变,那么一般情况下也可以不去理它。
另外,在NCBI上人类得基因得版本一直在变化,也就就是说同一个基因有不同得版本,或者称不同得亚型,其碱基序列有些许得差异,只要自己克隆出来得碱基序列与其中一个相匹配,一般也就可以不做定点突变了。
如果有时间没钱,那干脆重新PCR然后再克隆进自己得载体了,不过最好换个保真性好一点得酶如PFU,或者PCR循环数低一点,不过这些东西有时候也得靠运气啦.实在不行得话再来做定点突变.ﻫ对于第二种情况:
这种情况下一般也就只能做定点突变了.
接下来开始聊一聊定点突变得原理吧,那个Stratagene试剂盒!
上面有一个说明书,说得好像很正规,不过上面好多都就是什么专利啊什么注意之类得话,瞧都不瞧,我们简明扼要地只讲实验方面,通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来得就就是我们得PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
大家马上就会想到几个问题了:
ﻫ第一:
引物怎么设计呢?
ﻫ第二:
模板怎么去掉呢?
ﻫ第三:
怎么拿到质粒呢?
对于第一个问题:
怎么设计引物?
我只能讲一些原则,并举一些例子。
引物设计得原则其它贴子上都有讲,这里就不重复了:
不过这种突变引物要加上一个原则:
ﻫ一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为11—12basepair。
ﻫ若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,大家应该都知道,引物至少要11—12个basepair才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个base pair,并且合成多一条反向
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因 定点 突变 攻略