第十六章 标记抗体技术Word文档下载推荐.docx
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盖玻片:
上面培养单层细胞
首要要求是保持抗原的完整性,并尽可能减少形态变化,抗原位置保持不变。
标本要相当薄,有适当的固定处理方法
②固定:
常用丙酮和95%乙醇,室温固定15-30min后,用PBS反复冲洗,干后即可染色。
目的:
防止被检材料从玻片上脱落,消除抑制抗原抗体反应的因素。
检测细胞内的抗原,用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。
③检测:
A、直接法:
直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区,置湿盒中,于37度染色30min左右,然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min,干燥、封载,显微镜镜检
B、间接法:
将标本先滴加特异性的抗血清,置湿盒中,于37度作用30min,PBS漂洗5min后,再加入FITC标记的抗抗体,置湿盒中,37度作用30min,PBS漂洗5min,干燥、封载,显微镜观察
(5)注意事项:
①由于荧光容易淬灭,一般仅能维持几个小时,因此,荧光二抗应避光保存,即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。
封片后应尽早照相,目前有市售的荧光增强剂,可使荧光在4度保存1-2周仍不淬灭
②常用的荧光素有以下几种:
绿色荧光:
FITC,AlexaFluor488和GFP;
红色荧光:
TRITC,Cy3,Alexafluor568&
594和MitoTrackerRed;
蓝色荧光:
Hoechst,DAPI;
黄色荧光:
YFP,Fuo-3和Rhoda-mine123
③不同的荧光素激发的波长不同,因此,选用滤光片时要注意。
一般紫外线的激发波长为334-365nm,蓝光的激发波长为435-490nm,绿光的激发波长为546nm左右
④荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热,关闭30min后方可再开启
⑤免疫荧光的组织要求很高,载玻片即盖玻片要干净无杂质
(6)实际应用:
2、放射免疫分析的概念/所用放射性元素要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用
是将放射性同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术
(二)放射性元素的要求:
①低序号的常见元素,便于置换化合物中的同种元素进行标记②放射强度低或中等,降低对操作人员的危害③半衰期适中,既能保持检测时间,又便于环境中的处理。
常用3H,125I,32P,35S
(4)操作步骤
液相放射免疫测定(放免通常指液相法)
①试验基本过程:
(1)适量处理待测样品
(2)按一定要求加样,使待测抗原与标记抗原竞相与抗体结合
(3)反应平衡后,加入分离剂,将B和F分开
(4)分别测定B和F的脉冲数
(5)计算B/F值或B%,在标准曲线上查待测抗原的量
2加样与反应
有平衡饱和法和顺序饱和法
平衡饱和法:
将已知量的标记抗原*Ag和待测抗原相结合,然后加入抗血清(Ab),孵育一段时间,使反应达到平衡。
顺序饱和法:
将待测抗原与限量抗血清混合,孵育一段时间后,再将标记抗原加入。
因本法中待测Ag优先与Ab结合,故更敏感。
标记抗原的量应按制作标准曲线的量加入。
抗血清应稀释成能结合50%标准抗原的稀释度。
孵育时间按不同检测物而异,一般用4℃24h。
建立方法时应优化检测条件。
3分离与测定
(1)吸附法活性炭表面吸附蛋白时,就不能吸附大分子抗原抗体复合物,只能吸附游离的F。
离心,就可以将B与F分离。
(2)化学沉淀法PEG(聚乙二醇)可以将B沉淀,从而将B与F分离。
(3)双抗体沉淀法:
在反应液中加入一定的抗抗体,即可将B沉淀下来。
(5)注意事项
(1)编号:
第一排是标准管:
根据标准品浓度由低到高A,B,C,D,E,F,G……;
第二排是被测样品1,2,3,4,5,6,……。
(2)加样要准确,移液器的使用(两个档位,一档吸人,二档排出)吸头(一个标本一个吸头,避免互相污染)。
加试剂:
先看瓶签,再摇匀,最后吸人。
(标记物一般为红色,一抗为兰色)。
(3)温育时间要保证:
按说明书中所要求的时间温育,可以延长,不能缩短。
(4)分离剂加入:
混匀静置时间,可以延长,不能缩短。
保证抗原抗体复合物与第二抗体的充分结合。
(5)温度:
注意观察水浴箱的水温,误差不能太大,为±
1℃,室温21℃左右。
(6)离心时间:
也应按说明书中所要求来操作,转速一般为3500r/min。
往离心机里放反应管时,尽量让它直立(因为倾斜可能会使液体流出)。
吸上清液时,沉淀物在试管底部,真空泵的吸头头部不能直接插人到试管底部中央(会吸走沉淀物,而我们的目的是分离保留沉淀物),应该使吸头贴着试管管壁往下放,并且试管要稍微倾斜,但要在即将插到沉淀物边缘时停止,快速上升取出。
少留一点点上清液也可。
主要是保证沉淀物完整。
(7)进人免疫计数器测量时,注意观察做出的曲线好坏:
是不是需要修改,剔除坏点。
(8)报结果:
碰到异常结果,要再次看一看沉淀物是否都在,患者情况如何,结果是否与患者情况相符,方可报出。
非竞争性RIA法中,清洗固相包被珠时,清洗次数要严格按说明书中所要求来操作,不得减少。
虽然RIA法的影响因素很多,但操作中只要注意上述事项,RIA法的稳定性还是相当不错的。
主要是它存在放射污染,这个问题不易解决,影响了它以后的发展,如今电化学发光免疫分析,化学发光免疫分析,酶联免疫分析,磁酶免疫分析等相继推出,发展很快。
RIA法将被淘汰。
(6)实际应用
①疾病的诊治:
诊断传染病、寄生虫病,还广泛应用于各种内分泌疾病、心血管疾病和肿瘤疾病的诊断。
直接检测外周血中甲状腺激素T3T4的浓度,测定血清中肌红蛋白的浓度,早期诊断和治疗心肌梗塞。
对于肿瘤的诊断,用以诊断肝癌的甲胎蛋白
②激素等微量活性物质的测定
测定促甲状腺激素和促甲状腺释放激素的弄得
③药物检测:
检测中毒或用药过量,运动员获得的最佳成绩是否因为服用兴奋剂
3、免疫酶标记技术常见试验方法有哪些/试验原理
①直接法:
以酶标抗体处理标本,然后浸于含有相应底物和显色剂的反应液中,通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在
②间接法:
标本用相应的特异性抗体处理后,再加酶标记的抗抗体,然后经显色揭示抗原-抗体-抗抗体复合物的存在
③抗抗体搭桥法:
利用抗抗体既能与反应系统的抗体结合,又能与抗酶抗体结合(抗酶抗体与针对抗原的抗体必须是同源的)特性,以抗抗体作桥连接抗体和抗酶抗体。
先加抗体使与标本上的抗原发生特异性结合,然后加抗抗体与抗体结合,再加既能与抗抗体结合又能与酶结合的兔抗酶抗体,最后用底物显色。
④酶抗酶复合物法:
PAP法。
将HRP和抗HRP抗体结合形成酶抗酶抗体复合物PAP,用PAP来代替抗抗体搭桥法中的抗酶抗体和酶。
⑤杂交抗体法:
⑥增效抗体法:
4、酶联免疫吸附试验ELISA的各类型试验原理/试验方法/注意事项/结果判定方法/试验检测用途/各自区别
(1)各类型试验步骤
①间接法:
用于测抗体(如测AIV抗体)
(1)AIV病毒包被
(2)洗涤3~5次,每次3~5min
(3)封闭含1%OVA的PBS(pH7.2,浓度为10mmol)
(4)洗涤同上
(5)加待检抗体,置湿盒中,37℃作用1~2h
(6)洗涤同上
(7)加酶标记抗抗体,置湿盒中,37℃作用1~2h
(8)加底物显色,测OD值
②直接法:
用于测抗原(如沙门氏菌)
(1)待检抗原包被
(5)加酶标记的抗沙门氏菌的单抗,置湿盒中,37℃作用1~2h
(7)加底物显色,测OD值
③夹心法:
(又称双抗体法,用于测抗原)
(1)抗AIV多抗包被
(3)封闭含1%OVA的PBS(pH7.2,浓度为10mmol)
(5)加待检抗原,置湿盒中,37℃作用1~2h
(7)加酶标记抗AIV单抗,置湿盒中,37℃作用1~2h
④双抗体夹心法
(7)加抗AIV单抗,置湿盒中,37℃作用
1~2h
(8)洗涤同上
(9)加酶标记抗AIV单抗,置湿盒中,37℃作
用1~2h
(10)洗涤,加底物显色,测OD值
(二)注意事项
P58
(3)结果判定
结果判定:
样本OD值与一组阴性样本OD值均值之比即为P/N比值,
P/N≥1.5或2,3倍,判为阳性
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