胚胎植入前遗传学诊断筛查技术专家共识精编版Word文档格式.docx
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1.1.4人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)配型
曾生育过需要进行骨髓移植治疗的严重血液系统疾病患儿的夫妇,可以通过PGD选择生育一个和先前患儿HLA配型相同的同胞,通过从新生儿脐带血中采集造血干细胞进行移植,救治患病同胞。
1.2PGS的适应证
近期高通量遗传检测技术(PGS2.0版)的研究和发展,对PGS的临床意义提出了新的质疑,包括不同程度和部位胚胎染色体异常嵌合型的存在、临床检测技术的精准性、对移植胚胎的选择和放弃的标准、PGS的活产率计算方式及其应用价值等,提示PGS的循证证据尚需进一步的研究和验证,其指征也面临修正和更新。
目前PGS可应用于以下几个方面:
1.2.1女方高龄(advancedmaternalage,AMA)女方年龄38岁及以上。
1.2.2不明原因反复自然流产(recurrentmiscarriage,RM)反复自然流产2次及以上。
1.2.3不明原因反复种植失败(recurrentimplantationfailure,RIF)移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4~6个或高评分囊胚数3个及以上均失败。
1.2.4严重畸精子症
1.3PGD的禁忌证有以下情况之一者,不得实施PGD技术:
1.3.1目前基因诊断或基因定位不明的遗传性疾病。
1.3.2非疾病性状的选择,如性别、容貌、身高、肤色等。
1.3.3其他不适宜实施PGD的情况。
1.4其他几种特殊情况
1.4.1性染色体数目异常
如47,XYY、47,XXX等,产生性染色体异常后代的几率较低[1,2],不建议实施PGD;
而47,XXY生育后代染色体异常风险增加[3],可酌情考虑是否实施PGD。
1.4.2对于常见的染色体多态
如1qh+、9qh+、inv(9)(p12q13)、Yqh+等,不建议PGD。
2遗传咨询和知情同意
患者夫妇在选择实施PGD/PGS前,需要接受至少一次的遗传咨询,使其充分了解自身的生育和遗传风险,知晓现阶段可能的医学干预措施及其利弊,自愿选择治疗方式,并保存相关咨询记录资料。
2.1病史采集及家系分析
包括收集患者及相关家系成员的原始临床资料及遗传检测结果,绘制系谱图;
询问夫妇双方的疾病史、生育史、专科检查及健康评估结果;
对于HLA配型者,需评估患儿目前的病情及诊治情况,判断其病情是否允许等待。
2.2风险评估
结合家系调查和遗传检测结果,以及相关疾病的一般遗传发病规律,充分评估夫妇的再生育风险。
2.3知情选择
根据评估的生育风险告知可能的干预措施,如产前诊断、PGD/PGS、配子捐赠等,以及现阶段不同干预技术方案的优缺点,让夫妇自愿选择生育干预措施。
夫妇在选择PGD/PGS周期治疗前,需充分知晓整个过程中的各类风险,涉及常规体外受精的治疗过程、PGD/PGS技术造成的胚胎活检、冷冻复苏损伤、个别胚胎可能诊断不明、检测后无可移植胚胎、染色体嵌合型胚胎发育潜能的不确定性、无法常规鉴别染色体结构异常的携带者、由于胚胎自身的生物学特性以及检测技术的局限性可能导致误诊的风险、以及若获得持续妊娠,需行产前诊断确诊等。
3胚胎移植
3.1行PGD/PGS检测后的胚胎,建议行单胚胎移植。
3.2当本周期无完全正常的可移植胚胎时,患者经遗传咨询和知情同意后,可自愿选择移植非整倍体嵌合体异常胚胎[4],并依顺序优先选择移植不良风险较小的嵌合型胚胎。
3.3在对单基因疾病实施PGD时,携带致病基因突变但很可能不发病的胚胎可作为备选移植胚胎。
3.4可选择新鲜周期移植或者复苏周期移植。
4随访
PGD胚胎移植后获得持续妊娠者,需进行侵入性产前诊断。
现阶段不建议采用无创产前筛查的方法,并应随访妊娠的结局以及新生儿的情况。
5临床质控
5.1夫妇在进入PGD/PGS治疗周期前,需接受至少一次遗传咨询,并保存完整的咨询记录、知情同意书和病案记录。
5.2确定接受PGD/PGS周期治疗的夫妇的临床指征合理且充分。
5.3PGD获得持续妊娠者,产前诊断结果与胚胎检测结果符合率>
98%。
5.4对PGD/PGS的临床结局分析,建议使用活产率/每起始周期的统计方法。
第二部分胚胎实验室的显微操作与质控
1授精方式的选择
1.1卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)
PGD/PGS周期建议采用ICSI授精方式,以最大限度地减少母源颗粒细胞和父源精子对下游遗传学检测准确性的干扰,特别是下游检测拟采用核酸扩增技术者。
1.2常规体外受精(invitrofertilization,IVF)
使用荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)方法进行胚胎遗传学检测时,也可采用IVF授精后形成的囊胚,但应警惕精子和其他细胞核的污染。
2活检的时机
2.1极体活检
通过极体活检进行PGD/PGS,可分析判定母源遗传信息。
2.1.2第一极体活检:
可在取卵后实施,也可在ICSI后0.5~2h进行。
2.1.3第二极体活检:
在ICSI后8~14h第二极体排出后进行。
2.1.4在ICSI受精后8~14h内,可同时活检获取第一极体和第二极体。
2.2卵裂期活检
卵裂期活检一般在授精后66~70h进行,对此时发育至6~8细胞、碎片含量<
>
的胚胎进行活检。
通常活检1个卵裂球,最多不超过2个。
在卵裂期活检后,胚胎仍可继续生长发育2~3天,成为囊胚。
在该时间段内若能完成胚胎遗传学诊断,则可实行新鲜周期移植。
2.3囊胚活检
囊胚活检对胚胎发育的潜力影响较小,已成为目前PGD/PGS的主要活检方式。
囊胚期活检是在授精后第5~6天、囊胚充分扩张后进行。
建议活检囊胚评分应在4BB以上,活检细胞数以5~10个为宜。
通常囊胚活检后的胚胎需立即冷冻保存,待胚胎遗传学分析完成后,择期对结果正常的胚胎进行复苏移植。
3胚胎活检
3.1透明带打孔
3.1.1透明带打孔的方法有机械法、Tyrodes酸法和激光法。
目前激光法更为常用,在活检时应尽量避免对细胞造成热损伤。
3.1.2机械法打孔和激光法可以用于授精前的极体活检,Tyrodes酸法可能对纺锤体产生不利影响。
3.1.3卵裂期或囊胚期活检可以采用机械法、Tyrodes酸法和激光法。
3.1.4囊胚活检的透明带打孔可以在授精后第3天、第5天、活检前4h或活检时进行。
3.2活检细胞的数目
应根据遗传检测的要求,单独或同时移取第一或第二极体;
卵裂期活检应移取1~2个细胞。
若需移取2个细胞,则活检胚胎应包含≥6个细胞;
囊胚活检采集的滋养细胞数目应控制在5~10个。
3.3二次活检
反复活检将影响胚胎的发育潜力。
但在首次活检诊断不明时,可以考虑二次活检(包括卵裂期胚胎和囊胚);
如果胚胎活检后已冷冻,可以考虑复苏后再次活检[5]。
3.4选择活检的细胞
在卵裂期活检卵裂球时,应选择移取有核且为单核的细胞,囊胚活检应选择远离内细胞团的部位。
4活检胚胎的冷冻
在等待PGD/PGS遗传学检测结果时,需要对活检后的胚胎进行冷冻保存。
建议采用玻璃化冷冻技术,活检后的卵裂期或囊胚期的冷冻方法与常规胚胎冷冻方法相同。
5活检样本的预处理
5.1核酸扩增法检测的预处理
下游采用核酸扩增法进行遗传学检测者,活检所移取的细胞经过洗涤后应放入含有2.5μL磷酸盐缓冲液(或遗传检测试剂盒所要求的预装试剂)的PCR管中,同时移取少许洗涤液到空白PCR管中作为空白对照。
5.2FISH检测的预处理
不同的细胞固定方法均可以获得满意的效果;
在处理时应注意做好固定液的隔离防护措施。
6胚胎活检实验室的质量控制
6.1胚胎活检环境的质量控制
6.1.1同ICSI体外胚胎操作实验室标准,在百级层流、37℃恒温、覆盖于无菌矿物油下的无菌培养液滴中进行。
6.1.2为减少胚胎之间的相互污染,必须确保每个微滴中仅包含一个胚胎,活检针和活检材料转移吸管须无活检细胞成分的残留。
6.2胚胎活检人员的质量控制
胚胎活检技术人员应具备熟练的ICSI操作经验,在操作中全程遵循严格的无菌原则,以防外源性污染。
第三部分遗传实验室的遗传检测与质控
根据胚胎遗传检测的靶标,又可分为基因水平的检测和染色体水平的检测。
1基因水平的检测
1.1适用范围
经过规范的临床咨询,明确具有单基因遗传病高风险的夫妇;
夫妻双方或之一携带有严重疾病明确的遗传易感基因致病突变;
HLA配型选择。
1.2检测策略和原则要求
1.2.1为避免因扩增失败、优势扩增、等位基因脱扣(alleledrop-out,ADO)、样本污染等导致的误诊或诊断不明,建议PGD的胚胎基因检测应同时进行突变位点的直接分析和遗传多态位点连锁分析[6,7]。
1.2.2用于连锁分析的遗传多态位点可以是短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)或者单核苷酸多态位点(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。
1.2.3建议在致病突变位点上、下游1Mb的范围内分别选择至少2个可提供遗传信息的多态位点,同时避免选择同源性高、相邻序列中GC含量高或有多聚核苷酸序列的SNP位点。
1.2.4对于性连锁遗传病,建议加入性别指示位点的检测。
1.2.5对于HLA配型者,用于连锁分析的遗传多态位点需要覆盖HLA-A、HLA-B、HLA-DRA和HLA-DQB1的上、下游,在每个区域中至少选择5个可提供遗传信息的多态位点。
1.2.6在进行遗传多态位点连锁分析时,需注意突变位点附近的基因组重组。
1.3检测方法
1.3.1巢式PCR法
其中第一轮多重PCR应扩增多个目标位点(含突变位点以及连锁遗传的多态位点)。
1.3.2全基因组扩增(wholegenomeamplification,WGA)
又可分为基于PCR原理和非基于PCR原理的扩增方法。
WGA扩增的产物可采用多种方法进行突变位点及遗传连锁位点的鉴定,包括荧光PCR、Sanger测序、单核苷酸多态微阵列芯片(SNParray)[8,9]、高通量测序(nextgenerationsequencing,NGS)[6]以及联合检测等。
1.4PGD检测前的验证
1.
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