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辅因子
辅酶与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅基与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。
金属激活剂金属离子作为辅助因子。
必需基团:
这些基团若经化学修饰使其改变,则酶的活性丧失。
活性部位:
酶分子中直接与底物结合,并和酶催化作用直接有关的部位。
单体酶:
种类很少,一般仅有一条具有活性部位的多肽链,一般是参与水解反应。
寡聚酶:
由几个或多个亚基组成,亚基牢固地联在一起,单个亚基没有催化活性。
亚基之间以非共价键结合。
酶作为催化剂的特点
催化能力
催化转换数:
每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数
专一性
酶的专一性:
也称为酶的特异性,它是指酶对所作用底物(substrate)的选择性。
根据酶对底物的选择方式不同,酶的专一性分为:
绝对专一性和相对专一性。
绝对专一性:
指一种酶只选择一种底物作用,如脲酶。
相对专一性:
指一种酶选择一类底物作用。
根据酶选择的对象不同又分为:
键专一性(指酶对所作用键的选择性,如脂肪酶。
)基团专一性(指酶对所作用的键及键一侧的基团的选择性,如α-D-葡萄糖苷酶,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。
)
调节性
酶浓度调节激素调节共价修饰调节限制性蛋白水解作用与酶活力调控抑制剂的调节反馈调节金属离子和其他小分子化合物的调节
酶的分类及命名
分类:
酶的命名有两种方法:
系统名(包括所有底物的名称和反应类型)惯用名(只取一个较重要的底物名称和反应类型)
酶催化作用机制(课本P35)
偏重阐明专一性:
锁和钥匙模型诱导锲合模型中间产物学说
偏重阐明高效性:
酸碱催化共价催化邻近效应及定向效应张力和形变学说
酶催化反应动力学(课本P43)
米氏方程:
方程推导三点假设(平衡假设):
①与底物浓度[S]相比,酶的浓度[E]是很小的,因而可忽略由于生成中间复合物[ES]而消耗的底物。
②不考虑这个逆反应的存在。
若要忽略该反应的存在,则必须是产物P为零,换言之,该方程适用于反应的初始状态。
③认为基元反应ES→E+P的反应速率最慢,为该反应速率的控制步骤,而S+E→ES这一反应速率最快,并很快达到平衡状态。
米氏方程表达式:
修正的米氏方程:
km与ks的关系为:
由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同,不同的是ks值代表反应的平衡常数,而km值称为米氏常数,它代表动态的平衡常数,恒态时的浓率关系。
当K+2<
<
K+1时,km值才接近于ks
km是酶的特征性常数,km值代表反应速率为最大反应速率一半时的基质浓度,其单位为浓度单位。
km值是酶的一个很基本的特性常数,它和酶的浓度无关,但和温度、pH等因素有关。
根据km值可以推断酶和底物的亲和力。
如果酶的专一性不高,可催化几种底物发生反应时,km值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大,反之,则最小。
酶催化反应的抑制动力学课本P54
可逆抑制:
竞争性抑制:
一种最常见的酶活性的抑制作用,抑制剂与底物竞争,从而阻止底物与酶的结合。
其动力学特点是:
酶促反应的表观米氏常数增大、最大速度不变。
可以通过增加底物浓度来解除这种抑制。
反竞争性抑制:
对酶活性的一种抑制作用,由于所加入的抑制剂能与酶-底物复合物结合,而不与游离酶结合,所以其特征是反应的最大速度比未加抑制剂时反应的最大速度低,当以速度的倒数相对底物浓度的倒数作图,所得图线与未被抑制反应的图线平行。
非竞争性抑制:
抑制剂与酶分子在底物结合位点以外的部位结合,不影响酶与底物的结合。
因此,只影响酶催化反应的最大反应速度,不影响米氏常数,非竞争性抑制反应的双倒数图表现为在不同抑制剂浓度下,所有直线交横轴于一点。
类型
Vmax
Km
竞争性抑制
不变
增加
反竞争性抑制
减小
非竞争抑制
非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点是:
对竞争性抑制,随着底物浓度的增大,抑制剂的影响可减弱;
而对非竞争性抑制,即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。
从这个意义上说,竞争性抑制作用是可逆的,非竞争性抑制作用是不可逆的。
不可逆抑制:
以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。
分专一性(专一地作用于酶的活性中心或其必需基团,进行共价结合,从而抑制酶的活性。
)及非专一性(抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用,不论是必需基团与否,皆可共价结合,由于其中必需基团也被抑制剂结合,从而导致酶的抑制失活。
)两种。
常见产酶微生物
大肠杆菌醋酸杆菌枯草芽孢杆菌根霉曲霉
酶生物合成模式
同步合成型(一类发酵)
又称生长偶联型。
大部分组成酶的生物合成属于同步合成型(一类发酵),有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。
延续合成型
酶的生物合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后,酶还可以延续合成一段较长时间。
可以是合成酶,也可以是诱导酶
中期合成型(二类发酵)
该类型的酶在细胞生长一段时间以后开始,而在细胞生长进入平衡期以后,酶的生物合成随之停止。
中期合成型酶具有的共同特点是:
酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用,而酶所对应的mRNA稳定性较差。
滞后合成型(三类发酵)
此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后开始其生物合成并大量积累,又称为非生长偶联型。
许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
在酶的发酵生产中,为了提高产酶率和缩短发酵周期,最理想的合成模式应是延续合成型。
对于其他合成模式的酶,可以通过基因工程/细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使它们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
同步合成型的酶:
降低发酵温度,提高酶对应的mRNA的稳定性。
中期合成型的酶:
提高酶对应的mRNA的稳定性以及解除阻遏,使生物合成的开始时间提前,并尽量延迟生物合成的停止时间。
滞后合成型的酶:
设法降低培养基中阻遏物的浓度,尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用,使酶的生物合成提早开始。
固定化酶
固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。
♦优点:
不溶于水,易于与产物分离;
可反复使用;
可连续化生产;
稳定性好。
(热稳定性保存稳定性对蛋白酶的抵抗性对变性剂的耐受性)
♦缺点:
固定化过程中往往会引起酶的失活
固定化酶活力回收率低,且不适合用于高分子质量的底物。
酶固定化方法
载体结合法(物理吸附法离子结合法共价结合法)
交联法
包埋法(网格型微囊型)
热处理(细胞)
定向固定化
利用酶和它的抗体之间的亲和性
通过酶分子上的糖基部分固定化
酶和金属离子形成复合物
用分子生物学方法使酶定向固定化(基因融合法翻译后修饰法)
酶反应器用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
理想酶反应器的要求
(1)所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度(或细胞浓度),才能得到较大的产品转化率。
(2)能用电脑自动检测和调控,从而获得最佳的反应条件。
(3)应具有良好的传质和混合性能。
传质是指底物和产物在反应介质中的传递。
传质阻力是反应器速度限制的主要因素。
(4)应具有最佳的无菌条件,否则,杂菌污染使反应器的生产能力下降。
常见酶反应器
⏹按结构区分
♦搅拌罐式反应器(StirredTankReactor,STR)
♦鼓泡式反应器(bubblecolumnreactor,BCR)
♦填充床式反应器(packedcolumnreactor,PCR)
♦流化床式反应器(FluidizedBedReactor,FBR)
♦膜反应器(MembraneReactor,MR)
⏹按操作方式区分
♦分批式反应(batch)
♦连续式反应(continuous)
♦流加分批式反应(feedingbatch)
⏹混合形式
♦连续搅拌罐反应器(ContinuousStirredTankReactor,CSTR)
♦分批搅拌罐反应器(BatchStirredTankReactor,BSTR)
反应器类型
适用的操作方式
适用的酶
特点
搅拌罐式反应器
分批式,
流加分批式
连续式,
游离酶
反应比较完全,反应条件容易调节控制。
填充床式反应器
连续式
设备简单,操作方便,单位体积反应床的固定化酶密度大,可提高酶催化反应速度。
在工业生产中普遍使用。
流化床反应器
分批式
混合均匀,传质和传热效果好,温度和pH值的调节控制比较容易,不易堵塞,对粘度较大反应液也可进行催化反应。
鼓泡式反应器
结构简单,操作容易,剪切力小,混合效果好,传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。
膜反应器
结构紧凑,集反应与分离于一体,利于连续化生产,但易发生浓差极化而引起膜孔阻塞,清洗比较困难。
喷射式反应器
通入高压喷射蒸汽,实现酶与底物的混合,进行高温短时催化反应,适用于某些耐高温酶的反应
酶分子的修饰
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程
酶分子修饰的意义
☐提高酶的活力activity
☐增强酶的稳定性stability
☐降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty
☐改变酶的底物专一性和最适pH
☐研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure
酶分子修饰的方法
☐金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。
用于金属离子置换修饰的金属离子,一般都是二价金属离子。
☐侧链基团修饰(P1085.2)
采用一定的方法(一般为化学法)使酶蛋白的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法
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