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协调性差的引物对的效率和特异性都较差,因为降低了Tm值导致特异性的丧失。
这种情况下引物Tm值越高,其错误引发的机率也越大。
若采用太高的退火温度,Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。
在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时,这种GC含量和Tm值的协调非常关键。
一般来说,一对引物的Tm值相差尽量不超过2~3摄氏度,同时引物和产物的Tm值也不要相差太大,20摄氏度范围内较好。
④引物的额外序列与退火温度
若有额外的序列信息要加到引物中,例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。
一般说来,引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。
有时候,引物中添加了大量与模板不配对的碱基,可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环;
然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中,计算得出的退火温度下进行其余的循环。
在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基,这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。
长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算,而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。
对于低于20个碱基的引物,Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。
而对于较长的引物,Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到,现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。
⑤引物的3’末端核苷酸组成
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的,而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。
如果3’末端的错配过多,通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。
应特别注意引物不能互补,尤其是在3’末端。
引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现,这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。
这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态,从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基的ΔG。
此值的大小对扩增有较大的影响,负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高,同时也更易于异位引发。
需要注意的是,引物3’末端应尽量避免T。
实验证明,以T结尾的引物即使与T,G或C错配仍可有效延伸。
⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置
所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。
一般说来,PCR产物长度对扩增效率有影响。
特定的应用情况下,PCR产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。
若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法,120~300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。
产物应具有好的特异性和高的产生
效率,并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。
这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到,从而减少扩增时间。
其他PCR方法有不同的最佳产物长度。
例如,通过定量的RNA-PCR检测基因表达时,产物应该足够大以便构成竞争性模板,这样,产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。
这些产物一般在250~750bp范围内。
若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列,产物的大小是根据具体应用预选的。
在这里,计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。
在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时,应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列,因为它们可能没有任何的同源性。
3.简并引物设计
①设计简并引物时,一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。
很显然,我们期望选择简并度最低的氨基酸,达到提高特异性的目的。
②充分注意物种对于密码子的偏好性,选择该物种使用频率高的密码子,以降低引物的简并性。
③应努力避免3’末端的简并,对于大多数氨基酸残基来说,意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。
④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤(dI)代替简并碱基。
4.测序引物设计
当然,测序引物的设计一般都由测序公司来完成,如果需要自己设计的话;
那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外,还需要注意两点:
①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些,也就是说设计时更优先考虑特异性。
因为在测序反应中,如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸,会对结果对来很大的干扰
甚至造成结果无法识读。
②测序引物的Tm值适当高一些。
现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化,并采用PCR的热循环程序。
选用的测序引物的Tm值稍高一些,有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区,也有助于降低非特异反应。
5.探针的设计
探针的设计,根据不同的用途各有其设计特点,这里只是就通用的原则进行讨论:
①探针的长短一般在20-50核苷酸之间,过长合成成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长。
太短则特异性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60%,同时一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生。
③探针自身序列不能形成二聚体,也不能有“发夹”结构存在,这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。
④如果探针地靶目标是多个基因的混合物,就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在70%以下。
PCR中常见问题分析与对策.
PCR产物的电泳检测时间
一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型就会出现不规则,甚至消失。
Troubleshootingguide
1.假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:
①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致
假阴性。
需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。
引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物使用过程中应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度:
Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:
通常进行PCR扩增采用的体积为20μl、30μl、50μl或100μl,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20μl后,再做大体积时,一定要重新摸索条件,否则容易失败。
物理原因:
温度对PCR扩增来说相当重要。
如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;
退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;
退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计,检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异:
如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
引物设计不合适:
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:
这种污染有两种原因:
一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:
①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。
②除了酶及其他不耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及进样枪头均应一次性使用。
③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照
射,以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定
的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现,其原因:
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。
其次,是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:
①必要时,重新设计引物。
②减低酶的量或调换另一来源的酶。
③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用
二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸,也叫两步法)。
gene121(站内联系TA)
增加PCR的特异性:
1.primersdesign
这是最重要的一步。
理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
a.足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量
b.GC%40%~~~~60%
c.5'
端和中间序列要多GC,以增加稳定性
d.避免3'
端GCrich,最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC
e.避免3'
端的互补,否则容易造成DIMER
f.避免3'
端的错配
g.避免内部形成二级结构
h.附加序列(RTsite,Promotersequence)加到5'
端,在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们
i.使用兼并引物时,要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'
端使用兼并引物,并
使用较高的引物浓度(1uM-3uM)
j.最好学会使用一种designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesginetal.
*引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。
这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下,退火温度足够低,
以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2.stabilityofprimers
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM。
TE比去离子水好,因为水的pH经常偏酸,会引起寡核苷的水解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。
3.optimizereactantsconcentration
a.magnesiomions
Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性,一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整,同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相
应的调整Mg离子的浓度,对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液b.其他的离子
NH4+K+都会影响PCR,增加K+的浓度后,会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的严谨性(stringency),NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER,一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的,当然,过高的阳离子浓度(KCL>
0.2M)时,DNA在94度根本不会发生变性,当然也就无从谈起PCR了.
c.polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度,一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性
d.template
50ulPCRSYSTEM
================================
humangDNA0.1ug-1ug
E.Coli10ng-100ng
LamadaDNA0.5ng-5ng
PlasmidDNA0.1ng-10ng
4.termperature
a.denaturation
常规是94度5分钟,GCRich的摸板是95度5分钟
除了GCRich外,常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟,或者在CYCLE1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation
b.annealing
重点到了:
一般情况下,是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做gradientpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.因为,polymerase在annealingtemp.时也会有一些活性.所以在A.T.的时间过长,会极大的增加非特异性扩增的风险,另外,在对于一些困难户,比如从gDNA里扩增大片段,还可使用twos
tepPCR.
5.touchdownPCR
原理很简单,但的确是一个很有用的方法。
举个例子,ANNEALINGTEMP.55度
945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s
721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s
5130s721min2cycles9430s5030s
721min20cycles725min
6.hotstartPCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。
尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性。
因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。
这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效。
限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的PCR仪。
这种方法简单便宜,但并不能完成抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度。
包括延缓加入TaqDNA聚合酶,在反应体系达到90度时,PAUSE,将温度保持在70度以上,手工加入polymerase,但这个方法过于烦琐,尤其是对高通量应用,并容易造成污染。
其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,入镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开。
在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
有很多公司提供这样的酶。
=======================
ampliwaxPCRGems(PerkinElmer)
TaqBeadHotStartPolymerase(Promega)
Magnesiumwaxbeads(Stratagene).
=========================
象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。
还有一种方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗体抑制失活,当变性温度超过70度时,抗体也变性了,这样polymerase又被激活了。
7.BoosterPCR
我们知道1ughumangenomicDNA大约在3X105幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合.当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个boosterPCR我一直找不到合适的词来翻译这个booster.
具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:
template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平
8.循环数和长度
确定循环数的基本原理是:
产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造成ERRORS和非特异性产物的积累产物的量不够,优化的方法有:
1.增加TEMPLATE
2.增加循环数
如何确定循环数,有一个方法.
做一个PCR体系,40循环,50ul,分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数
另一个会影响PCR特异性的是PCRcycling时在两个温度间变化的速率(rampingrate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地
9.thermalcycler
PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).
10.PCRadditives
附加物或者说enhancer实在是多种多样.基本上包括几类,能够增加反应退火效率的化学
因子,DNA结合蛋白和一些商业试剂.基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配,增加产物的长度和产量.
在GCRich情况中,additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定,而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradientpcr选择最优条件.
====================================================dimethylsulfoxide(DMSO)upto10%
formamideat5%
trimethylammoniumchloride10-100uM
detergentssuchasTween200.1-2.5%
polyethyleneglycol(PEG)60005-15%
glycerol10-15%
singlestrandedDNAbindingproteins
Gene32protein1nM
E.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM
7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTP
TaqExtender(stratagene)
PerfectMatchPCREnhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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- 引物 设计 PCR