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1前言
蜂蜜是我们日常生活经常食用的食品,也是一种极受欢迎的保健品。
蜂蜜来源于各种花类,蜜蜂通过采集花朵的花蜜,再经历酿造过程和加工过程,成为我们日常所见的蜂蜜产品。
然而,这个过程极为复杂,植物的花里会分泌一些液体,这些液体包含着蔗糖,维生素等有机物,这就是花蜜。
花蜜吸引蜜蜂来吸食,蜜蜂先将花蜜存放在蜜囊里,回到蜂巢后,将其吐入蜂巢,再去采集。
到了夜间,蜜蜂会将蜂巢里的蜂蜜重新吸回蜜囊,自身分泌一种特殊的活性物质,进行催化反应。
之后,再吐回蜂巢,反复进行的呕吐过程就是酿造。
酿造过程中,蜂蜜中的氨基酸,糖类等有机物达到了一定的丰富度,更重要的是把花蜜中的多糖转变成人体可直接吸收的单糖--葡萄糖、果糖。
蜂蜜是一种受欢迎的保健佳品,其医疗保健作用除用于便秘、促进消化外,还可用于润肺止咳、控制高血压、增强体质、美容养颜、心脏病、贫血、动脉硬化、肺部疾病、关节炎、眼科疾病等的辅助治疗,还有杀菌的作用[1],这也是蜂蜜不会变质的原因。
蜂蜜中的挥发性物质是蜂蜜中的重要组成部分,据此可以判断蜂蜜的品质优良,还可以判断其蜜源。
在食品加工方面,还可以根据挥发性物质组成成分,合成相应的蜂蜜香精。
1.1蜂蜜中挥发性成分研究现状
蜂蜜中的挥发性成分不仅可以用来判断蜂蜜蜜源,判断真伪。
还可以为制作蜂蜜香精提供了新的思路,目前,国内外分析蜂蜜中的挥发性成分的方法有溶剂萃取法(SE),同时蒸馏萃取法(SDE),动态顶空法(DHS),固相微萃取法(SPME),电子鼻(E-nose)[2]。
它们的作用原理和使用优缺点如下表1-1所示:
表1-1萃取方法及优缺点
工作原理
优点
缺点
溶剂萃取法(SE)
由有机相和水相相互混合组成,使水相中要分离出的物质进入有机相后,再依据两相质量密度不同将两相分开,得到目标物。
有机溶剂用量少,所需时间短,萃取效率高,选择性好,使用方便、安全性好,自动化程度高[3]。
溶剂使用量比较大、产生的废弃物较多。
蒸馏萃取法(SDE)
利用样品蒸汽和萃取溶剂的蒸汽在密闭的装置中充分混合,各组
分在低于各自沸点能被蒸馏出来,蒸馏时混合物的沸点将保持不变,当其中某一组分被完全蒸出后,温度才上升到留在瓶中组分沸点。
挥发性成分首先被蒸馏出来,然后和萃取剂在螺旋形冷凝管上完成萃取,根据萃取剂与水比重的差异将两者分开,最后回收萃取
液[4]。
减少了实验步骤,节省了大量溶剂,同时也降低了样品在转移过程中的损失
操作温度需要在高温下进行
动态顶空法(DHS)
用惰性气体通入液体样品(或固体表面),把要分析的组分吹扫出来,使之通过一个盛有吸附剂的容器进行富集,然后再把吸附剂加热,使被吸附的组分脱附,用载气带入气相色谱柱中进行分析。
动态顶空分析法有富集的功能,对痕量组分的分析比较有利[5]。
免去样品萃取、浓集等步骤,还可避免供试品种非挥发组分对色柱谱的污染。
要求待测物有足够的挥发性,所用时间长,吹扫中有可能引入杂质以及吸附剂性能的选择等。
固相微萃取法(SPME)
SPME采用类似气相色谱微量进样器的萃取装置,用一根涂渍多聚物固定相的熔融石英纤维从液/气态基质中萃取待测物,然后将富集有待测物的纤维直接转移到色谱仪中,通过一定的方式解吸附,然后进行分离分析[6]。
溶剂用量少,重现性好、易操作、易于实现自动化、检出限低。
纤维头价格昂贵,使用的寿命短[7]。
电子鼻(E-nose)
利用各个气敏器件对复杂成分气体都有响应却又互不相同这一特点,借助数据处理方法对多种气味进行识别,从而对气味质量进行分析与评定[8]。
响应时间短、检测速度快,避免人为误差,重复性好,灵敏度高,能检测一些人鼻不能够检测的气体。
价格昂贵
1.2分散液液微萃取技术
分散液-液微萃取是一种新型液相微萃取技术,于2006年问世的。
它作用的原理是基于使用注射器将包含有微升级(μL)萃取剂的分散剂快速注入试样溶液内,形成喷雾状,使萃取剂在分散剂-水相内形成萃取微珠。
这样在分散剂的作用下就大大地有效扩展了有机萃取剂和水样之间相接触面积,从而大大加快了萃取平衡的速度,使目标化合物迅速萃入萃取剂微珠内,提高了萃取效率和富集倍数[9]。
分散液液微萃取作为一项新的萃取方式,有很好的发展前景和应用范围。
DLLME具有萃取平衡的速度快,使用有机萃取剂的剂量非常小,操作简便,消耗低,污染少,萃取效率和富集倍数高等一系列优点。
与后续的检测方法(气相色谱、石墨炉原子吸收光谱、液相色谱、薄层色谱、质谱、分光光度、火焰原子吸收光谱等)有很好的相容性[10]。
适用范围广,既适用于痕量有机物的分离富集,也适用于痕量无机金属离子的分离富集,已成功地应用于各个行业,包括各种坏境水样、化妆品、多种饮料、生物样品、各种矿物样品中痕量组分的分离富集,是一种操作简便且有发展前途的环境友好的分离富集技术[11]。
图1-1分散液液微萃取操作流程示意图
本实验采用液液微萃取方法提取蜂蜜中的挥发性成分,然后用气相色谱-质谱联用仪分析其中挥发性成分。
2蜂蜜中挥发性成分的分析
2.1实验材料,试剂及仪器
材料:
洋槐花蜂蜜(延边宝利祥蜂业有限公司)
试剂:
1,2-二氯乙烷、四氯化碳、三氯甲烷均为分析纯;
乙腈、甲醇均为色谱纯;
实验室用水为去离子水;
氯化钠(分析纯)。
仪器:
HP6890Gc/5973Ms型气相色谱一质谱联用仪(美国安捷伦公司),
KQ-50B型超声波清洗器(昆山超声波仪器厂)
2.2样品的预处理
称取1g蜂蜜样品,加入1.5ml去离子水,再加入等体积的乙腈色谱纯,混合搅拌,放入漩涡振荡器作用3分钟,使之均匀形成均一的溶液。
再用离心机离心5min,用注射器吸取上面淡黄色油状有机层,封闭处理留作备用。
2.3分散液液微萃取条件的优化
2.3.1蜂蜜溶液浓度的选择
在预处理阶段,取1克蜂蜜分别加入0.9ml,1.2ml,1.5ml,1.8ml,2.1ml的去离子水,然后再分别加入等体积乙腈。
混合搅拌均匀,使之均匀形成均一的溶液。
再用离心机离心5min,观察现象。
2.3.2萃取剂的选择
取0.1ml的乙腈色谱纯作为分散剂,分别加入等体积70μl的1,2一二氯乙烷、四氯化碳、三氯甲烷为萃取剂作为不同的实验条件,事先把萃取剂和分散剂混合均匀。
在1.5mL的离心管中放入0.2ml的预处理得到的乙腈萃取液,再加入0.8ml的水,0.1g的氯化钠进行实验。
2.3.3分散剂的选择
分别取甲醇,丙酮,乙腈为分散剂,分别加入70μl的四氯化碳为萃取剂,事先把萃取剂和分散剂混合均匀。
在1.5mL的离心管中放入0.2mL的预处理得到的乙腈萃取液,再加入0.8mL的水,0.1g的氯化钠进行实验。
2.3.4萃取剂的体积
取四氯化碳体积分别为50、60、70、80、90μl,混入0.1ml的分散剂乙腈,在1.5mL的离心管中放入0.2mL的预处理得到的乙腈萃取液,再加入0.8mL的水,0.1g的氯化钠进行实验。
2.3.5分散剂的体积选择
取不同体积0.08mL,0.10mL,0.12mL的乙腈分散剂,分别加入70μl的四氯化碳为萃取剂,事先把萃取剂和分散剂混合均匀。
在1.5ml的离心管中放入0.2mL的预处理得到的乙腈萃取液,再加入0.8ml的水,0.1g的氯化钠进行实验,观察。
2.3.6萃取时间的选择
制备5个实验条件完全相同的试样,在分散剂与萃取剂加入到样本中到开始离心前,设置不同的萃取时间-2min、3min、4min、5min、6min。
记录实验结果。
2.3.7离子强度(NaCl)的影响
制备5个试样,取乙腈为分散剂,分别加入70μl的四氯化碳为萃取剂,事先把萃取剂和分散剂混合均匀。
在1.5mL的离心管中放入0.2mL的预处理得到的乙腈萃取液,再加入0.8mL的水,分别加入0.04g,0.06g,0.08g,0.10g的氯化钠进行实验。
2.3.8酸度的影响
保持其他实验条件相同,调节实验的pH分别为2,3,4,5,6,7条件下进行实验,观察。
2.3.9震荡方式的影响
保持其他实验条件相同,在对样液进行离心前,分别采用手摇,漩涡振荡器,超声波清洗器三种方式进行震荡,使之形成均一的液相,进行实验。
2.4结果与讨论
2.4.1蜂蜜溶液浓度的选择
在样品的预处理上,蜂蜜与水和乙腈的比例对实验结果起着重要作用。
在操作过程中,水的用量过少会使蜂蜜仍然呈黏稠状,而水的用量过多会使预处理产物过少。
实验结果显示,最佳用水量1g蜂蜜加1.5毫升水。
2.4.2萃取剂的选择
在萃取剂的选择上,一方面要求其是在水中的溶解度要足够小,另一方面要求对要分析的目标物质有很好的萃取效果,而且在后续的萃取相与随后的仪器分析方法有良好的相容性和适用性[12]。
实验结果显示:
在用四氯化碳为萃取剂时,分析出的物质种类最多,形成的峰最尖锐,并且形成的两相最佳稳定。
如下图2-1,图2-2,图2-3所示。
因此,本实验采用最佳的萃取剂为四氯化碳。
图2-1四氯化碳为萃取剂时蜂蜜离子流图
图2-2二氯乙烷为萃取剂时蜂蜜离子流图
图2-3三氯甲烷为萃取剂时蜂蜜离子流图
2.4.3分散剂的选择
在分散剂的选择方面,要求分散剂与萃取溶剂和水都要有良好的相溶性,而在分相时又要能形成两相,同时不干扰目标化合物分析,自身性质要具有毒性低和价格便宜。
一般实验常选用的的分散剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃等[13]。
本实验分别取甲醇,丙酮,乙腈为分散剂,实验结果表明:
最佳的分散剂为乙腈,其富集倍数较高,效果最佳。
2.4.4萃取剂的体积
选择萃取剂体积对萃取过程中的富集倍数及萃取结果影响较大。
本实验考察四氯化碳体积(50、60、70、80、90μL)对萃取效率及富集倍数的影响。
随着四氯化碳用量的增长,萃取效率变化不明显,而当体积增大到80μL,以后富集倍数急剧下降.原因是随着萃取剂的加入量的增大使有机相的体积变大,从而使有机相中的目标物的浓度变小,从而影响目标物的富集倍数使得方法灵敏度也降低。
当萃取体剂体积为70μL时,在这一条件下既可以有较好的萃取效率又有较高的富集倍数,因此确定萃取剂的体积为70μL。
2.4.5分散剂的体积选择
分散剂体积也是分散液相微萃取中一个重要影响因素。
如果分散剂体积过小会使萃取剂在水相中难以形成均一的乳浊液从而影响萃取效率,而当分散剂体积较大时则会影响有机相在水中的溶解性。
因此,选择合适的分散剂体积显得尤为重要。
本实验考察了乙腈不同体积(0.08mL,0.10mL,0.12mL。
)对微萃取的影响。
实验结果显示,萃取效率先随乙腈体积的增加而增加,在0.10mL时达到最大值,而后又随乙腈体积的增加有机相体积过大,影响富集倍数。
因此本实验选择分散剂乙腈体积为0.1mL。
2.4.6萃取时间的选择
实验结果显示不同的提取时间对萃取效率没有明显的影响。
说明当萃取剂加入到水相体系中能迅速形成均一的乳浊液,待测物可以从水相中迅速转移至有机相中,从而达到两相平衡。
因此,为了节省时间,本实验选取提取时间2min。
2.4.7离子强度(NaCl)的影响
加入的盐类通常NaCl,用于加强萃取效率。
是本实验中考察了加入不同质量的NaCl对萃取结果的影响,实验结果显示当NaCl质量从0.04g按照0.02g的增加量增加至0.10g时富集倍数成增加趋势且萃取效率逐渐成上升趋势;
但当浓度继续增加时,氯化钠的溶解度达到饱和,会有沉积,并且富集倍数出现下降现象。
分析导致这一结果的原因可能是当NaCl浓度过高时会使有机相在水相中溶解性降低,使得有机相体积增大从而影响富集倍数。
鉴于此本实验中确定NaCl质量为0.1g较为适宜(换算成浓度约为0.1/0.24×
100%=4.1%左右)。
2.4.8酸度的影响
溶液的pH值可能影响蜂蜜中的挥发性成分的萃取效率,也可能对挥发性物质有一定的破坏作用。
对照实验结果显示观察其最佳pH为中性条件。
因此本实验在中性条件下对其进行微萃取。
2.4.9震荡方式的影响
对照结果显示,不同的震荡方式对结果的影响并不明显。
原因可能是在用注射器注入萃取剂与分散剂时是形成萃取微珠的关键步骤,故震荡方式对实验结果影响并不大。
2.5分散液液微萃取蜂蜜中的挥发性成分
取0.1mL的乙腈色谱纯作为分散剂,加入70μl的CCl4作为萃取剂,事先把萃取剂和分散剂混合均匀。
在1.5mL的离心管中放入0.2mL的预处理得到的乙腈萃取液,再加入0.8mL的水,0.1g的氯化钠,摇匀。
待固体氯化钠溶解充分后,着用1ml的微量注射器吸取已经混匀的萃取剂和分散剂的混合液,快速注入离心管中,使之在短速时间内形成大数目的微珠萃取粒子。
再把离心管放在漩涡振荡器上作用3分钟使之形成均一的乳浊液,然后用离心机以4000r/min的速度离心5min。
待离心机马达停止后,取出离心管,可观察到在离心管中出现分层现象。
萃取的目标产物沉积在离心管的底部。
2.6蜂蜜中挥发性成分的分析
2.6.1色谱条件及质谱条件
色谱条件:
色谱柱HP—FFAP25m×
0.20mm×
0.33μm.弹性石英毛细管柱:
进样口温度250℃;
程序升温:
50℃(保持5min)→220℃,升温速率为5℃/min;
载气为He气,流速为1mL/min.
质谱条件:
离子源为电子轰击源,离子源温度230℃二;
电离电压70eV;
电子倍增器电压1648V;
发射电流34.6μA;
接口温度230℃;
扫描范围:
20~500m/z;
溶剂延迟3min。
2.6.2分析蜂蜜中的挥发性成分
用微量进样器取离心管下层相2μL,直接注入气相色谱一质谱联用仪进行分析检测。
以G1701BA化学工作站检索Nist98标准谱库鉴定蜂蜜中的挥发性成分,得到结果见图2-4及表2-1所示。
2-4最优条件下的蜂蜜总离子流图
表2-1蜂蜜挥发性成分及含量
编号
保留时间(min)
百分比(%)
化合物名称
1
9.19
1.57
1-羟基,2-丙酮
2
9.63
1.74
甲酸甲酯
3
10.88
1.68
呋喃甲醛
4
11.20
5.72
乙酸
5
12.21
3.53
甲酸
6
13.52
0.41
5-甲基糠醛
7
15.27
1.51
2-呋喃甲醇
8
17.39
0.29
2(5H)-呋喃酮
9
17.62
0.64
1,2-环戊二酮
10
20.38
0.73
苯乙醇
11
22.85
1.95
2,3-二羟基丙醛
12
23.83
15.81
1,3-二羟基丙酮
13
27.07
3.22
4-甲基-二氧六烷
14
31.14
17.88
5-羟基糠醛
15
31.41
0.83
5-甲基-2-噻吩甲醛
16
31.64
0.61
1,2-乙二醇
17
31.82
0.46
5-羟甲基糠醛
18
32.68
5.46
2(3H)-呋喃酮
3结论
在最优的条件下:
取0.2mL蜂蜜的乙腈萃取液,0.8mL的去离子水,0.1g的NaCl,以0.1ml乙腈为分散剂加70μL四氯化碳为萃取剂,气质联用分析共测定出蜂蜜中的18种挥发性物质。
其中,主要物质为醛类化合物,酮类化合物,有机酸以及少量酯类,烷类。
而根据已有文献记载,蜂蜜中主要的挥发性成分有醇类、酮类、醛类、酸类和萜烯类等物质[14]。
实验结果与理论依据稍有偏差。
其中,糠醛和羟甲基呋喃甲醛是从蜂蜜中的葡萄糖和果糖中分解出来的产物,可作为蜂蜜质量的量度,若贮存温度不宜或掺有杂质糖浆,呋喃和羟甲基糖醛的含量会相对较高[15]。
利用分散液液微萃取技术提取蜂蜜中的挥发性成分,并进行分析,其实验样品用量少,所用时间短,无需加热,避免了加热过程中的损失。
可作为分析蜂蜜质量的一种可靠地分析方法。
对于液微萃取的适用范围和操作,还有待进一步研究。
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(2):
7-8
致谢
我历时将近两个多月时间完成了这篇论文。
这个过程,给大学的最后时光带来了充实感和乐趣。
当然,也遇到了各种各样的困难和问题。
在大家的帮助和个人的努力下,都一一解决了。
在此,我向指导和帮助过我的老师和同学们表示最真诚的谢意!
尤其要强烈感谢我的论文指导老师化学与生命科学学院副院长李铁纯老师,感谢他对我进行了耐心地指导和帮助。
在实验过程中,前几次结果很不佳,老师耐心给我讲解探究实验方案。
在论文的后续修改中,老师无私地为我进行论文的修改和改进,使我顺利完成了毕业论文。
此外,我还要感谢我所引用的文献和期刊的作者们,他们为我的论文提供了宝贵的资源。
最后,感谢鞍山师范学院给我带来了四年的丰富多彩的大学生活。
由于我的学术水平有限,知识面有限,所写论文难免有不足和错误之处,希望各位老师和同学给予指正和意见!
再次表示感谢!
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