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致病机理;
RNA病毒;
免疫逃避;
遗传
牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)是引起牛腹泻病及粘膜病的主要病原,临床症状复杂多样,可表现为亚临床感染,或出现繁殖障碍和由免疫抑制导致的呼吸系统、消化系统性疾病,以及由血小板减少、出血导致的致死性粘膜病。
由于BVDV致病机理复杂,并且缺乏有效的防控技术,因此BVDV在世界范围内广泛流行,是造成全球乳/牛业经济损失的重要病原。
此外,随着体外受精与胚胎移植在养牛业中的普及和应用,研究人员发现利用感染有BVDV的精液培育出来的胚胎若移植到受体母牛代孕后,受体母牛和新生犊牛均会成为BVDV携带者,这会进一步造成养牛产业的经济损失。
近年来,BVDV病毒疫情呈现再次爆发的势头,给畜牧业和人类健康带来了严重危害。
BVDV属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pes-tivirus),同属的病毒还包括猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)及边界病毒(borderdiseasevirus,BDV),它们同源性较高,能突破宿主特异性,发生交叉感染。
BVDV是有囊膜的单股正链RNA病毒,仅有一种血清型,不同毒株间存在遗传多样性,及存在大量基因亚型的病毒株。
根据病毒基因组5&
prime;
非翻译区(5&
UTR)序列差异性,将病毒分为I、II两个基因型,根据能否产生细胞病变,把BVDV毒株分为非致细胞病变型和致细胞病变型。
研究人员通过将属于基因型的不同亚型的病毒株所产生的中和抗体进行了基因亚型之间的交叉保护实验,结果发现基因亚型之间的血清型在一定程度上是可以形成交叉保护力的,但是也有个别基因亚型的中和抗体无法中和其他亚型的感染力,这都为研究人员在建立针对BVDV的疫苗与鉴别诊断提供了很好的实验依据。
国内外研究者对BVDV进行了大量研究,阐明了病毒感染等机制,但对该病毒与宿主之间相互影响机制等多方面仍面临许多问题。
本文就BVDV分子生物学研究现状进行综述,为进一步研究奠定理论基础。
1BVDV基因组结构
BVDV为单股正链RNA病毒,基因组全长大约12.5kb,整个基因组由5&
UTR、一个大的开放阅读框(openreadingframe,ORF)、3&
非翻译区(3&
untranslatedregion,3&
UTR)组成。
ORF编码区编码一条长约4000个氨基酸的多聚蛋白前体多肽链,并由细胞和病毒基因编码的蛋白酶在翻译时和翻译后进行加工,生成成熟的病毒蛋白,它们在基因组上的位置从N端到C端依次为:
NH2-Npro-cap-sid-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH.其中Capsid、Erns、E1和E2为BVDV的结构蛋白,构成BVDV的衣壳和囊膜,其余8种为病毒的非结构蛋白。
这些病毒蛋白在子代病毒的产生过程中发挥着重要作用,同时也是诱导机体产生对BVDV侵染的抗病毒天然免疫方面发挥着重要的作用。
1.1BVDV的5&
及3&
非翻译区
BVDV5&
UTR约由380~385个核苷酸组成,通过自身核苷酸序列折叠可以形成由不同茎环组成的特殊二级结构,这种二级结构具有与宿主细胞的翻译起始和延伸相关蛋白质结合互作的功能,从而借助细胞内相关蛋白因子调节BVDV基因组的复制及翻译。
BVDV开放阅读框的翻译不是依赖5&
端甲基化帽状结构的翻译起始机制来行使病毒相关基因的翻译,而是由其基因组5&
UTR内部所含有的核糖体内部进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)介导核糖体对翻译起始密码子的识别并激发其下游基因的翻译起始事件。
核糖体中的18SrRNA3&
端的保守序列GUCGAAACAAGG与5&
UTR区IRES的核苷酸互补,通过碱基配对而结合,这样有利于蛋白质的启动翻译。
5&
UTR序列很保守,因此可根据此段序列进行BVDV分型,瘟病毒属5&
UTR区序列的高度同源性和相似的二级结构,说明这一结构在病毒基因组转录、翻译过程中起到重要作用,瘟病毒属病毒可能以相似的机制进行转录和翻译。
BVDV的3&
UTR由223~230个核苷酸组成,属内成员保守性高,无PolyA尾结构。
研究表明,黄病毒科3&
及5&
UTR参与病毒的基因组的复制、翻译功能,亦与病毒非结构蛋白NS5B同RNA模板链的识别有关。
1.2BVDV的开放阅读框
BVDV的开放阅读框编码相对分子质量约为450000的前体多聚蛋白。
该前体蛋白进一步由病毒和细胞的酶加工成BVDV核衣壳的核心蛋白C(P14)、3种囊膜蛋白E0(gp48)、E1(gp25)、E2(gp53),此外还有几种非结构蛋白。
结构蛋白与非结构蛋白共同作用,参与病毒复制、传播等过程。
2BVDV的结构蛋白
2.1核心蛋白P14
核心蛋白P14,也称核衣壳蛋C,位于ORF的第505~810位核苷酸,由102个氨基酸残基组成。
Elashi等构建了p14基因的重组腺病毒,免疫小鼠后,小鼠脾细胞与基因I型和II型BVDV均能产生特异性免疫反应,表明p14蛋白具有免疫原性。
研究发现,C蛋白在丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)中,具有转录调控因子的作用,能够抑制基因组中核糖体结合位点的活性,从而抑制病毒复制、翻译过程,降低病毒增殖效率,呈现病毒持续性感染的状态,但C蛋白在瘟病毒属中是否具有同样的功能尚不清楚。
2.2病毒囊膜
蛋白病毒的囊膜由三种糖蛋白组成:
E0、E1、E2,无论是在感染的宿主细胞还是在病毒粒子上,糖蛋白之间均通过二硫键连接,形成异源二聚体,这种结构对于病毒粒子的组装非常重要,这些异源二聚体构成病毒的囊膜结构。
2.2.1囊膜蛋白E0
囊膜蛋白E0又称Erns或gp48,其编码框位于ORF的第811~1491位氨基酸,由227个氨基酸残基组成,有潜在的8个糖基化位点,相对分子质量约为27000,不含有锚定肽
.氨基酸序列分析结果表明,在这一蛋白质内存在一高度保守结构域,这暗示了保守结构域在维持E0蛋白正常生理活性方面发挥着重要作用。
该蛋白质除了是一种囊膜蛋白外,同时具有核糖核酸酶活性,但该活性在瘟病毒增殖及使机体致病过程中所起的作用尚不明确。
值得注意的是,当BVDV侵染细胞后,E0蛋白可以被过量表达,这一现象表明E0基因可为开发基因工程疫苗以及检测试剂盒提供候选基因。
由于E0产生的中和抗体具有中和BVDV和CSFV感染细胞的能力,这为利用猪瘟疫苗来预防牛感染BVDV提供了可以借鉴的线索。
对于CSFV的E0蛋白来说,其表达后可以高效抑制&
beta;
干扰素的产生,从而实现病毒对免疫反应的逃避。
这一生物学活动也可能发生在BVDV的侵染过程中,这有助于实现BVDV对宿主机体的持续性感染。
此外,E0蛋白还具有神经毒性及抗蠕虫能力,同时在病毒入侵细胞的过程中,E0也发挥了重要作用,能与细胞表面的膜蛋白相互作用。
E0蛋白还可以通过降解细胞凋亡因子来抑制细胞的凋亡。
2.2.2囊膜蛋白E1
囊膜蛋白E1基因位于ORF的第1492~2076位核苷酸,由195个氨基酸残基组成,有3个糖基化位点,相对分子质量约为20000,氨基酸序列中有两段高度疏水区,推测其为跨膜蛋白,以C端的疏水区锚定在BVDV囊膜蛋白上,E1可能在病毒包装成熟过程中协助E0定位,但这种糖蛋白无法诱导机体产生中和抗体。
2.2.4囊膜蛋白E2E2蛋白同样为病毒的囊膜糖蛋白,具有保守的糖基化位点,是BVDV的主要保护性抗原蛋白。
该蛋白由374个氨基酸残基构成,相对分子质量约为42000.
E2蛋白具有很高的变异率,高变异率为BVDV感染宿主机体后实现持续性感染提供了物质基础,这也是导致传统疫苗无法完全保护的主要原因。
该蛋白质有19个Cys残基和5个潜在的糖基化位点,这些位点在不同的毒株中均非常保守。
E2蛋白N端突出于BVDV囊膜表面,富含四个以构象表位为主的抗原决定簇,是病毒的主要抗原区域,也是与宿主细胞识别、吸附的重要部位。
此外,在E2蛋白C端有一段以YYEP为核心序列的线性表位,并且包含一个疏水膜锚定区,可以协助E2蛋白锚定在囊膜上。
E2蛋白一直是国内外学者研究瘟病毒的重点,尤其是对其表达和免疫原性的研究中。
在BVDV核酸疫苗的研究过程中,以往的研究都是停留在实验小鼠体内可以产生较高的抗体水平,但是在自然宿主体内产生抗体水平的能力受到了很大的限制。
鉴于这种情况,研究人员利用在天然免疫中发挥重要作用的RIG-I受体基因与E2基因在动物体内共表达,从而明显提高了基因工程疫苗在自然宿主体内诱导高水平抗体的产生。
在亚单位疫苗的研究中,利用昆虫细胞表达系统来进行的研究成果逐渐受到疫苗学家的关注。
Pecora等依托昆虫细胞表达系统实现了针对BVDV基因型1和2的E2蛋白的单链抗体的表达,并且发现犊牛和豚鼠均能产生很好的抗体水平,并且分别利用两种基因型的病毒对犊牛进行攻毒后,均有良好的保护效果。
Fu等证实CP型BVDV能引起细胞的自噬,且在此过程中,细胞中病毒囊膜蛋白E0及E2表达量显着上升,推测这两种蛋白质可能参与了诱发细胞自噬的过程。
硫氧还蛋白(Trx2)是真核细胞中线粒体呼吸链上的关键蛋白质,参与细胞多项生理过程,Trx2与E2蛋白的互作已被GSTpulldown、激光共聚焦等实验证实,通过RNA干扰实验沉默PK细胞中的Trx2基因后,明显促进了病毒的增殖,此外,Trx2通过促进P65亚基NF-&
kappa;
B向细胞核的转位,增强NF-&
B启动子活性,而由肿瘤坏死因子(TNF-&
alpha;
)诱导的NF-&
B信号通路的激活则抑制了病毒的复制。
3BVDV的非结构蛋白
瘟病毒属病毒的结构蛋白的生物学功能已经研究得比较透彻,而非结构蛋白功能的研究相对较少。
近年来研究结果表明,非结构蛋白在病毒复制、宿主细胞功能调节及致病性方面有非常重要的作用,对这些功能的深入研究也为BVDV新型疫苗及靶标药物的研发提供了理论依据。
3.1非结构蛋白Npro
Npro是由168个氨基酸残基组成,相对分子质量为23000.
Npro是BVDVORF编码的第一多聚蛋白,具有自身蛋白水解酶活性,能催化自身从正在翻译的多聚蛋白的第168位氨基酸残基(Cys)和第169位氨基酸残基(Ser)构成的裂解位点处裂解下来,成为病毒复制过程中第一个具有生物学活性的病毒蛋白产物。
此外,Npro的蛋白酶活性随着自身从多聚蛋白上的解离,其蛋白水解酶活性丧失。
通过瘟病毒属成员氨基酸序列比对发现,Npro的同源性较高,其中E22-H29-C69基序高度保守,构成了酶学活性中心。
通过对Npro蛋白结构的研究发现,H29-C69构成了酶的催化中心,而E22位于酶催化中心之外,不参与酶催化反应。
Npro裂解位点位于C168-S169,并且这一裂解位点基序在所有瘟病毒属成员中均十分保守。
这暗示了瘟病毒属不同种类病毒的Npro蛋白在生物学功能上具有一定的相似性。
Npro对于病毒的复制不是必需的,但在病毒的增殖及病毒抗宿主天然免疫方面起着重要的作用。
进一步研究表明,瘟病毒属病毒Npro可以诱导细胞内蛋白酶降解干扰素调节因子3,从而阻止干扰素刺激基因的转录活化。
此外,BVDV感染细胞后,Npro与抗凋亡蛋白结合后抑制感染细胞发生凋亡,这在一定程度上提高了病毒增殖的效率。
3.2非结构蛋白P7
P7蛋白位于E2蛋白与NS2蛋白之间,是由疏水氨基酸构成的一个小分子蛋白肽,这种蛋白小肽并非病毒粒子的主要结构组分。
P7蛋白在多聚蛋白中的位置是结构蛋白和非结构蛋白承上启下的接头,而P7的产生是由宿主信号肽酶介导。
体外实验证明,P7可以在脂质双分子层膜上形成通道蛋白且具有离子通道的活性。
P7蛋白能调节细胞膜的通透性,从而协助病毒进入宿主细胞及后期病毒的组装释放。
虽然P7蛋白不参与病毒的复制过程,但是在病毒的侵染性及病毒侵染性颗粒形成中发挥重要作用。
如果利用离子通道阻断剂来处理受感染细胞,则通过抑制P7蛋白作为离子通道的生物活性来干扰子代病毒的释放。
近年来,研究者对黄病毒科病毒的感染、基因的复制翻译、病毒感染导致细胞凋亡及自噬等机制研究取得了很多大的进步,然而也仅限于对HCV及CSFV的研究。
虽然,有学者利用转录组学技术对BVDV侵染模式细胞(MDBK)后,分析了感染细胞内部基因转录水平的变化并且发现了一些与细胞分化、发育和代谢相关的功能基因的转录水平发生了变化,但是BVDV相关方面还并不十分清楚,甚至处于空白阶段,如BVDV的非结构蛋白如何参与调解调节病毒基因的复制翻译及细胞蛋白与病毒蛋白互作等机制仍有待阐明。
另外,非结构蛋白在病毒致病性中发挥重要作用的机制也不清楚,而要阐明以上问题必须将病毒非结构蛋白的结构及功能研究清楚。
通过对参与病毒基因转录翻译调控的病毒蛋白及宿主重要蛋白结构及功能的深入研究,进一步阐明非结构蛋白在对抗宿主细胞中的作用机理,为该病的预防及控制提供可靠的参考依据。
参考文献
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分子生物学论文范文精选二:
三阴性乳腺癌的分子生物标记的研究进展
Notch、Wnt和Hh信号通路均参与了三阴性乳腺癌的发生发展。
Aurora激酶A、Chk1、miR-93等在三阴性乳腺癌中存在过表达,并与其预后相关,为其治疗提供了新靶点。
三阴性;
乳腺癌;
信号通路;
靶向治疗;
三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcarcinoma,TNBC)是指免疫组织化学检查显示雌激素受体(es-trogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronere-ceptor,PR)和人表皮生长因子受体2(humanepider-malgrowthfactorreceptor-2,HER-2)均为阴性的一种特殊的乳腺癌[1]。
TNBC为预后最差的乳腺癌亚型,具有侵袭性强、恶性程度高、预后差等特点[2],除化疗外尚无有效的全身治疗措施,依靠现有的临床和病理指标难以对三阴性乳腺癌患者进行最优化的个体化治疗和预后分析。
尽管对PARP抑制剂及EGFR分子靶向药物的研究不断深入,但最近的临床研究结果却不尽如人意。
本文结合TNBC分子生物学标记,寻找能够影响TNBC预后的分子生物学因素及潜在的可用治疗靶点,以期指导临床治疗。
1三阴性乳腺癌分子生物标记
1.1Aurora激酶A
人类Aurora激酶A最早从乳腺癌组织中检测到,基因定位于20ql3.2,这个区域在许多恶性肿瘤中都存在基因扩增。
Aurora激酶A是胞质分裂的关键调节子,由403个氨基酸组成,是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一。
目前已有研究表明,Aurora激酶A在染色体分裂和细胞分裂中发挥着重要作用,其过表达与肿瘤侵袭和转移也存在很大程度的相关性[3]。
田富国等[4]应用免疫组织化学法检测137例TNBC及132例非TNBC患者Aurora激酶A表达,Aurora激酶A在三阴性乳腺癌表达率为73.7%,明显高于在非三阴性乳腺癌中的表达率46.2%(P<
0.05),并且与TNBC组织学分级、VEGF、p53、淋巴结转移和5年无病生存期呈相关性。
Alisertib(MLN8237)是一种选择性Aurora激酶A抑制剂,多项Ⅰ期、Ⅱ期临床试验正在进行。
Alisertib联合多西他赛对TNBC移植瘤实验研究发现两者协同具有明显和持续的抗肿瘤效应,为Alis-ertib临床研究的安全性和抗肿瘤效应提供了依据。
AS703569(R763)是一种非特异性Aurora激酶抑制剂,研究发现TNBC细胞株较其他类型乳腺癌细胞对AS703569更具敏感性,AS703569能将细胞阻滞在G2/M期,呈浓度和时间依赖性,并对体内外TNBC细胞和人源细胞移植瘤有较强的抑瘤作用。
MK-0457(VX680)是基于Aurora激酶的ATP结合口袋设计的一个4,6-二氨基嘧啶衍生物,靶向ATP结合位点,非特异性抑制AuroraA、B、C,其联合Vorinostat相关临床前期研究发现两者结合用药能够有效抑制三阴性细胞系MDA-MB-231小鼠移植瘤瘤体大小,并延长带瘤生存期[5]。
1.2细胞周期检查点激酶1
细胞周期检查点激酶1(checkpointkinase1,Chk1)作为一种蛋白激酶,含有200个氨基酸的复合物,包含一个N-末端激酶结构域和一个C-末端结构域,是G2期DNA损伤检查点的效应分子,其定位于染色体11q24,由E2F转录因子所调控的,其转录水平与E2F1转录水平高度相关。
Chk1不仅为正常细胞周期进程所必需,而且也是细胞分裂中维持基因组完整性不可缺少的,同时与细胞耐药密切相关。
杨洋等[6]研究发现Chk1在TNBC中的阳性表达率为68.09%,在非TNBC中的表达率为46.15%,Chk1表达与TNBC病理分级有关,但与肿瘤大小、淋巴结转移、绝经状态、病理类型及临床分期无关。
也有研究显示Chk1高表达可能是肿瘤对化疗药物敏感性降低的重要因素之一。
有学者将UCN-01联合伊立替康作用于人源小鼠肿瘤模型,结果提示CHK1抑制剂在p53缺失TNBC模型中具有抑瘤效果[7]。
UCN-01是第一个应用于临床的非选择性CHK1抑制剂,Ma等[8]一项关于UCN-01联合伊立替康治疗转移性TNBC的Ⅱ期研究中总有效率为4%,治疗失败时间为1.7个月,UCN-01疗效不尽人意更多归于其药代动力学。
AZD7762是新型CHK1选择性抑制剂,通过与CHK1的ATO结合位点可逆结合而抑制其磷酸化,诱导细胞周期停滞。
1.3p53
p53定位于17p13.1,是迄今为止发现与人类肿瘤相关性最高的基因,几乎50%以上的癌症都与p53有关。
野生型p53是一种抑癌基因,而突变型p53则丧失了抑癌作用,成为一种促癌因子,具有促进肿瘤形成、转化细胞活性的作用,因半衰期不同,免疫组织化学染色法可以检测的到为突变型p53。
p53作为一个重要的乳腺癌预后判断指标,与肿瘤侵袭性、转移性、耐药性均存在相关性。
相比其他类型,p53突变在基底样乳腺癌更常见[9]。
Simone等[10]报道p53在TNBC中的阳性率为54.7%,并与年龄、种族和预后存在相关性[11]。
张勤等[12]报道TNBC中p53阳性表达明显高于非TNBC组,且阳性组更易发生复发和转移,多因素分析显示p53可作为TNBC患者无疾病生存时间的独立预后因素。
Ryu等[13]研究发现p53和Bcl-2阴性联合表达预示了TNBC的预后不良,但仍需要大样本研究支持。
Chael等[14]分析了135例接受含蒽环类药物方案进行辅助化疗的乳腺浸润性导管癌患者的p53表达,p53阳性TNBC患者的总生存率以及无复发生存率均明显低于p53阴性TNBC患者,单因素分析显示p53状态与TNBC患者的总生存率和无复发生存率相关。
1.4miR-93
miR-93是miR-106-25簇的成员之一,研究发现miR-106-25簇存在于染色体7q22MCM7基因的第13个因子。
Smith等[15]证实高表达miR-106b和miR-93的乳腺癌患者易早期出现复发,其内在机制是Six1介导TGF-&
由抑癌活性转为促癌活性,进而诱导miR-106b和miR-93表达,而后两者可诱导EMT促进肿瘤复发转移。
赵晓艾等[16]研究发现miR-93在三阴性乳腺癌中呈弥漫性分布,其高表达率为52.5%,且TNBC中miR-93高表达率与腋下淋巴结转移阳性、TNM高分期及Ki67阳性相关。
miR-93表达异常可能参与
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