流式细胞仪的原理和用途文档格式.docx
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2.1流式细胞仪工作道理 除电源外,流式细胞仪次要由四部分构成:
流动室和液流零碎:
激光源和光学零碎;
光电管和检测零碎;
计算机和分析零碎,其中流动室是仪器的核心部件.这四大部件共同完成了旌旗灯号的发生、转换和传输的任务.
流动室和液流零碎
流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等构成,经常使用光学玻璃、石英等透明、波动的材料建造.设计和建造均很精细,是液流零碎的心脏.样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力感化下从样品管射出;
鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包抄在样品外周后从喷嘴射出.为了包管液流是稳液,普通限制液流速度υ<
10m/s.因为鞘液的感化,被检测细胞被限制在液流的轴线上.流动室上装有压电晶体,受到振荡旌旗灯号可发生振动.
激光源和光学零碎
经特异荧光染色的细胞须要合适的光源照耀激发才干发出荧光供收集检测.经常使用的光源有弧光灯和激光;
激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器.光源的选择次要根据被激发物质的激发光谱而定.汞灯是最经常使用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400nm,很适合须要用紫外光激发的场合.氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强,约占总光强的80%;
氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647nm较强.免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器.将无机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应须要即构成染料激光器.例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550~650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效力最高,约可占到一半.为使细胞得到均匀照耀,并提高分辨率,照耀到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径附近.是以需将激光光束经透镜会聚.光斑直径d可由下式确定:
d=4λf/πD.λ为激光波长;
f为透镜焦距;
D为激光束直径.色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所须要的波长λ.为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片.带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过.例如使用525nm带通滤片只答应FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过.长波通过二向色性反射镜只答应某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射.在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光旌旗灯号,就采取二向色性反射镜,或二向色性分光器,来无效地将各种荧光分开.
光电管和检测零碎
经荧光染色的细胞受合适的光激发后所发生的荧光是通过光电转换器转酿成电旌旗灯号而进行测量的.光电倍增管(PMT)最为经常使用.PMT的呼应时间短,仅为ns数量级;
光谱呼应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高.光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ,是以对弱光测量十分有益.光电管运转时特别要留意波动性成绩,工作电压要十分波动,工作电流及功率不克不及太大.普通功耗低于0.5W;
最大阳极电流在几个毫安.此外要留意对光电管进行暗适应处理,并留意良好的磁屏蔽.在使用中还要留意安装地位分歧的PMT,因为光谱呼应特性分歧,不宜互换.也有效硅光电二极管的,它在强光下波动性比PMT好.
从PMT输出的电旌旗灯号仍然较弱,须要经过放大后才干输入分析仪器.流式细胞计中普通备有两类放大器.一类是输出旌旗灯号辐度与输入旌旗灯号成线性关系,称为线性放大器.线性放大器适用于在较小范围内变更的旌旗灯号和代表生物学线性过程的旌旗灯号,例DNA测量等.另一类是对数放大器,输出旌旗灯号和输入旌旗灯号之间成经常使用对数关系.在免疫学测量中常使用对数放大器.因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1~2个数量级;
而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器收集数据易于解释.此外还有调节 便当、细胞群体分布外形不容易受外界工作条件影响等长处.
计算机和分析零碎
经放大后的电旌旗灯号被送往计算机分析器.多道的道数是和电旌旗灯号的脉冲高度绝对应的,也是和光旌旗灯号的强弱相干的.对应道数年纵坐标通常代表发出该旌旗灯号的细胞绝对数目.多道分析器出来的旌旗灯号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用.计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数.存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,最初给出结果.除上述四个次要部分外,还备有电源及紧缩气体等附加安装.
2.1.1旌旗灯号的发生、转换和传输 在压力感化下,鞘液管中的鞘液被持续不竭地压入流动室,构成一股波动地连续的液流,包管了样本液波动地处于鞘液液流的轴线上,并以单个细胞方式直线通过激光照耀区.激光照耀区又称测量区,是指液流与激光束垂直订交的点.当细胞携带荧光素标识表记标帜物(每种物质携带的标识表记标帜物分歧吗?
)通过激光照耀区时,发生代表细胞内部分歧物质、分歧波长的荧光旌旗灯号,这些旌旗灯号以细胞为中间,向空间360°
立体角发射,发生散射光和荧光旌旗灯号.散射光不依附任何细胞样品的制备技术,是以被称为细胞的物理参数或固有参数.散射光又包含前向角散射和测向角散射.前向角散射与被测细胞直径的平方密切相干,测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息.荧光旌旗灯号也有二种;
一种是细胞本身在激光照耀下发出的微弱荧光旌旗灯号,另一种是经过特异荧光素标识表记标帜后的细胞受激发照耀后得到的荧光旌旗灯号.在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光旌旗灯号,就采取二向色性反射镜,或二向色性分光器,来无效地将各种荧光分开.
经荧光染色的细胞受到适合的光激发后发生的荧光是通过光电转换器转酿成电旌旗灯号而进行测量的.最经常使用的光电转换器是光电倍增管(PMT).从PMT输出的电旌旗灯号须要经过放大后才干输入分析仪器.流式细胞仪中普通备有两类放大器.一类是线性放大器,其输出旌旗灯号与输入旌旗灯号成线性关系.线性放大器适用于在较小范围内变更的旌旗灯号和代表生物学线性过程的旌旗灯号,如DNA测量等.另一类是对数放大器,其输出旌旗灯号和输入旌旗灯号之间成经常使用对数关系.在免疫学测量中常使用对数放大器.放大后的电旌旗灯号被传送到计算机,再经模一数转换器传输到微机处理器构成数据文件,保管在计算机上.保管在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析.
参数(例如:
细胞的大小、外形、质膜和细胞内部结构)测量道理
流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息次要来自特异性荧光旌旗灯号及非荧光散射旌旗灯号.测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照耀激光束和喷出喷孔的液流束垂直订交点.液流地方的单个细胞通过测量区时,受到激光照耀会向立体角为2π(360°
)的全部空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长不异.散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、外形、质膜和细胞内部结构密切相干,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关.未蒙受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射,是以可利用分歧的散射光旌旗灯号对不经染色活细胞进行分析和分选.经过固定的和染色处理的细胞因为光学性质的改变,其散射光旌旗灯号当然分歧于活细胞.散射光不但与作为散射中间的细胞的参数相干,还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物身分有关.
在流式细胞术测量中,经常使用的是两种散射方向的散射光测量:
①前向角(即0角)散射(FSC);
②侧向散射(SSC),又称90角散射.这时候所说的角度指的是激光束照耀方向与收集散射光旌旗灯号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度.普通说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;
对球形活细胞经实验标明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;
对于外形复杂具有取向性的细胞则可能差别很大,特别须要留意.侧向散射光的测量次要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息.侧向散射光虽然也与细胞的外形和大小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映.
在实际使用中,仪器首先要对光散射旌旗灯号进行测量.当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞.光散射测量最无效的用处是从非均一的群体中鉴别出某些亚群.
荧光旌旗灯号次要包含两部分:
①自觉荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照耀后所发出的荧光;
②特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照耀激光分歧.自觉荧光旌旗灯号为噪声旌旗灯号,在多数情况下会干扰对特异荧光旌旗灯号的分辨和测量.在免疫细胞化学等测量中,对于结合水平不高的荧光抗体来说,如何提高信噪比是个关键.普通说来,细胞成分中能够发生的自觉荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高,自觉荧光越强;
培养细胞中死细胞/活细胞比例越高,自觉荧光越强;
细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自觉荧光越强.
减少自觉荧光干扰、提高信噪比的次要措施是:
①尽量选用较亮的荧光染料;
②选用适宜的激光和滤片光学零碎;
③采取电子抵偿电路,将自觉荧光的本底贡献予以抵偿.
2.1.2流式细胞仪分选道理 其实不是所有的流式细胞仪都具有分选功能.流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的.由喷嘴射出的液流柱在电旌旗灯号感化下发生振动,断裂构成均匀的小液滴.根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中.使用分歧孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选后果.从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电须要一段延迟时间.精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,可根据具体请求进行适当调整.
2.1.3数据的显示和分析 数据处理次要包含数据的显示和分析.单参数直方图是使用最多的图形显示方式,既可用于定性分析,又可用于定量分析.单参数直方图是由X、Y二方向构成的二维平面图.横座标X是所测的荧光或散射光的强度,用“道数”(ChannelNo.)来暗示.选择的放大器类型分歧,标度分歧.纵座标Y通常暗示被测细胞的绝对数目.正常情况下,数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图.对曲线图的解释应当具体成绩具体分析.
除直方图外,数据显示方式还包含二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等.二维点图也是比较经常使用的数据显示类型.它显示两个独立参数与细胞绝对数之间的关系,也是二维平面图,横纵坐标可以根据本人选定的被测参数自行决定,点的地位标明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值.二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图.
数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类.当被检测的生物学零碎能够用某种数学模型时则多使用参数方法.非参数分析法不必对显示的图像做任何假设,也不采取数学模型,分析程序可以很简单,也可能很复杂.临床医学较常使用非参数分析法.
2.2流式细胞仪功能的技术目标 流式细胞仪功能的技术目标次要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等.荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离,通经常使用变异系数(CV值)来暗示.此刻市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应当小于2.0%.荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力.普通用荧光微球上可测出的FITC的起码分子数来暗示.目前仪器均可达到1000摆布.仪器工作时样品浓度普通在105~107细胞/ml.分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目.普通分析速度为5000~10000,分选速度控制在1000以下.
流式细胞仪测量的数据是绝对值,是以须要在使用前对零碎进行校准或标定.流式细胞仪的校准有二个目的,即仪器的准直调整和定量标度.通常使用尺度微球作为非生物学尺度样品,鸡血红细胞做为生物学尺度样品.
3主流流式细胞仪型号及其特性介绍
目前具有市场较大份额的公司是美国的BD(Becton-Dickinson)公司、Beckman-Coulter公司(原名称Coulter)和德国的Partec公司.
3.1BD公司流式细胞仪介绍 BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs(fluorescenceactivatedcellsorter),即荧光激活细胞分选器.其型号品种比较齐全,如初期的FACSort、FACSCanto、FACSean.此刻市场上供应的型号有五种:
FACSCount(小型流式细胞仪)、FACSCAlibur(流式细胞仪)、FACSAria(流式细胞分选仪)、FACSVantageSETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSRII(数字化分析型流式细胞仪).
FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3,CD4,CD8绝对数而设计的.FACSCalibur是全主动多色流式零碎,偏重于临床,其全体设计帮忙临床大夫快速实现惯例免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析,兼具分选功能.配备有二根激光管,可同时检测4个荧光参数.可识别粘联细胞.
BDFACSAria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪,获取速度达70,000细胞/s,分析速度达50,000/s.使用石英杯流动检测池固定光路校准技术.使用三种激光,多色分析,分析参数可达15色.两管或四管分选,可以使用多种规格的收集管.液流监测零碎白动监测液流断点,检查堵塞,实现了细胞分选的无人操纵.配件BDACDU安装,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞.
FACSVantageSETM是在FACSVantage的细胞分选功能基础上推出的分选加强型流式细胞仪.六色荧光分析零碎,点对点分选,配置FACSDiva数字化零碎,提供全面的配套试剂.速度和功能优于FACSVantage.
BDLSRII是LSR的数字化升级版,其功能介于FACSVantageSE和FACSCalibur之间,是专为生命科学研讨设计的台式机.配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子零碎数字化、比较易学易用.
3.2Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍 Beckman-Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile(初期,现已停产)和EPICS系列为代表,近年又推出了CytomicsFC500系列.EPICS系列是大型流式细胞仪,目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号,其中ALTRA具有分选功能,适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析.CytomicsFC500系列流式细胞仪体积小,可主动进行5种色彩的分析,适用于免疫学检测,如人类HIV诊断.特别是FC500MPL的独特设计可以在同一零碎上使用12×
75mm的离心管和24或96孔的平板.特别适合工作量大的实验室.
这二个公司次要针对医学研讨和临床工作进行设计和生产,其产品可利用于生物医学基础研讨和临床检测的很多领域,如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研讨中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测初期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等.这二个公司的流式细胞仪价格昂贵,我国次要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构.
3.3Partec公司流式细胞仪介绍 与BD和Becman-Coutler公司的产品比拟,德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小,造价低,易操纵,便于携带,适合植物学研讨,适合悠远地区和发展中国家.德国Partec公司的产品分为三类:
CCA家族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy为初期产品,已停产).CCA家族包含细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I.它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些惯例分析,如核DNA测定(检测倍性或细胞周期)、细胞计数、细胞凋亡.它的特点是体积小,易操纵,价格低,检测范围广,可以检测多种荧光素(如PI、DAPI、Fluorescein)发出的荧光.PAS家族包含粒子分析零碎PAS、粒子分析零碎III(PAS-III)和倍性分析仪PA-II.提供三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光染料.最多可检测和记录八个独立荧光参数.倍性分析仪PA能够在2分钟内主动测量植物的倍性水平,检测异倍体.可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物质料进行分析.在大多数植物中,异倍体染色体的检测分辨率为±
1条染色体.PA-I使用HBO-100汞灯,属于弧光灯,可发生紫外激发光和蓝光.PA-II中添加了488nm氩离子激光器,能够检测几乎所有的荧光染料,如DAPI,Hoeehst,PI,EB,MMC,FITC,FDA等.汞灯发光是电流经过气体时,气体电离发生的.它能提供最好的激发波长.
CyFlow(R)SL配备三种激光管,可利用于诸如人类健康、微生物学、工业利用、过程控制、生态学等研讨.如HIV扫描中免疫标识表记标帜细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等.它使用l2V直流电,特别适合悠远地区和发展中国家.
国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测利用到植物的研讨中(Galbraith,1983),浩繁学者都认为流式细胞仪是一种精确、快速的检测DNA含量的方法(Michaelson,1991).利用范围主如果利用流式细胞仪研讨属内、属间多莳植物的DNA含量(Baird,1994;
Jacob,1996;
HALL,2000)和倍性水平(Costich,1993;
Meng,2002)、检测体细胞杂种(Pfosser,1995;
Keller,1996)和游离小孢子培养再生株(Kim,2003)的DNA含量.过去我国利用这一检测技术的植物研讨工作者寥寥无几,且大多是在国外实验室完成的.研讨内容包含植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等.植物研讨中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品,也有少量是BD公司生产的流式细胞仪.BD公司的产品次要定位于医学研讨与利用,与Partec产品比拟,不太适合从事植物染色体倍性的鉴定.次要体此刻不克不及提供植物样品制备技术/试剂,数据获取软件可同时检测到的倍性数目少.鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪,鄙人一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做具体陈述.
如何选择流式细胞仪
自七十年代出现第一代流式细胞仪以来,随着计算机技术、电子建造技术、激光技术及荧光素合成技术的不竭发展,古代流式细胞仪已今非昔比,建造工艺、功能、精确度有了质的飞跃.
流式细胞仪生产厂商推出各种分歧型号的流式细胞仪来满足用户的分歧须要.现生产流式细胞的厂商全球至多有六家,各厂商产品又有分歧的系列,各具特点.如何从浩繁的型号中挑选出最适合本人的机型,我们还需从分析利用出发,评估本人的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合本人.
⑴、DNA倍体分析
DNA分析是流式细胞仪最初且是此刻利用最广检测项目.因为恶性细胞DNA含量通常与正常细胞分歧,存在异倍体细胞,所以现有很研讨评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系.DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中应用很广泛.特别地,它可暗示出细胞毒性药物对细胞感化过程.这些DNA检测还可与细胞概况标记物标识表记标帜同时进行,如许在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标记物的细胞显示其生长周期情况.所无方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,经常使用的染料为PI,DAPI.
流式细胞仪请求:
488nm光源,575nm滤光片.
⑵、细胞生存能力实验
使用Heochest33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活力分歧,染料的结合程度也各异,故可评估细胞的活性度.
360nm光源,455nm滤光片.
⑶、计数外周血中检测网织红细胞
使用TO染料能够特异性地与RNA结合,结合系数高达3000,故具有很好的性价比.
488nm光源,525nm滤光片,液量绝对计数零碎.
⑷、外周血、骨髓收集物中CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定
使用尺度ISHAG方案,须要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE标识表记标帜CD34抗体,PE-CY5标识表记标帜CD45抗体.
488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片,液量绝对计数零碎.
⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验
检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有侧次要临床意义,因为这类反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症.流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白.FITC标识表记标帜人免疫球蛋白抗体、PE标识表记标帜粒细胞概况标记物、PE-CY5标识表记标帜HLA抗体.
488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.
⑹、血小板本身抗体检测
血小板本身抗体识他人血小板抗原,会惹起各种临床相干症状,如重生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少.流式细胞可快速精确地检测血小板本身抗体.FITC标识表记标帜抗人免疫球蛋白抗体、PE标识表记标帜识别血小板抗体.
488nm光源,525nm、575nm滤光片.
⑺、移植交叉配型
原细胞毒实验,次要用于防止移植物超急性排拆反应.流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,作为HLA配型前的
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