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2012年5月8日
摘要
研究污水对农作物种子萌发的影响,有效预测和避免可能产生的危害非常必要。
本论文研究了生活污水以及自制的洗涤废水对蚕豆种子萌发的影响,采用的主要检测方法是蚕豆根尖微核检测技术,检测指标是种子的萌发率以及根尖细胞的微核率。
分别用武昌工学院周边的生活污水和实验室自制的洗涤废水作为诱变剂,处理并测定测定蚕豆种子的萌发率和根尖细胞的微核率,实验结果表明,经过处理后的蚕豆萌发率有所下降,根尖细胞的微核率有所上升。
结论是:
经过污水处理的蚕豆种子萌发率变化不大,外观上经过处理的种子生长状况比没有被污水处理的种子要好一些,细胞的微核率有所增加;
经过洗涤废水处理的蚕豆种子萌发率明显降低,外观上生长状况也是比没有经过处理的种子长的差,细胞微核率明显增加。
关键词:
蚕豆;
微核试验;
生活污水;
洗涤废水
Abstract
Studyofcropseedgerminationofsewage,theeffectsoftheeffectiveforecastandavoidtheharmisverynecessary.Thispaperstudiesthesewageandwastewatertowashthehomemadeseedgerminationofbroadbean,theinfluenceofthemajortestisaviciafabaofmicronucleustesttechnology,testingindexisthegerminationofseedsratio,andtherootcellsmicronucleusrate.Withthesurroundingtechrespectivelywuchangsewageandlaboratoryhomemadewashingwastewaterasamutagen,processingandthedeterminationofseedgerminationratedeterminationfavabeansandrootcellsofmicronucleusrate,theexperimentalresultsshowthataftertreatmentofhorsebeangerminationratiofell,rootcellsofmicronucleusraterose.Theconclusionis:
afterthesewagetreatmentofhorsebeangerminationratevarymuchappearanceontheseedsofprocessedgrowthsituationofsewagetreatmentisbetterthannobetterseeds,thecellsofmicronucleusrateincreases;
Afterwashingwastewatertreatmentofthebeansgerminationratereducedsignificantly,andappearancetothegrowthconditionisalsobetterthannoprocessedseedispoor,cellmicronucleusrateincreasedsignificantly.
Keywords:
beans;
Thetest;
Sewage;
Washingwastewater
引论
利用城市里的废水灌溉农作物始于西欧和北美,我国在80年代中期污灌面积就已经达到了250万余hm2。
污水灌溉根据其灌溉的方式主要分为了两种,一是城市污水经排污渠直接引到郊区主动灌溉农田,二是流经该地区的河流受到污染被动污灌。
前种形式主要出现在北方地区,后种形式在南方地区多见。
1992年,山西省原平县污水灌溉农田造成60多公顷的农作物枯死。
除了这些,一些学者经过研究发现,某些重金属含量较低的污水灌溉农田之后不仅不会产生可见的毒害,还可能使作物增产,但作物可食部分含有的重金属含量却会明显增加,对人类健康存在着潜在的伤害。
然而,水资源短缺,环境水资源污染现象普遍。
我国地面水最常见的水污染是有机污染、重金属污染、富营养污染以及与这些污染共存的复合性污染。
近年来难降解合成有机物污染受到广泛注意,它们即使在十分低的含量下也可能对人体健康产生直接危害,如致癌、致突变等,严重影响了人民群众的生活和工农业生产[1]。
微核技术是以染色体断裂及纺锤体损伤等为测试终点的检测环境中化学有毒物质和环境污染物的致癌、致突变性的方法,当外界环境中存在致突变物时,可诱导细胞产生染色体断片,形成微核,由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比,因此以蚕豆根尖为实验材料的微核技术已用于环境致突变性检测,并广泛用于检测水源、土壤、大气等环境中污染物的致癌和致突变性[2]。
蚕豆根尖细胞微核实验技术在环境污染检测中已被我国定为“生物检测技术”而得到广泛应用[3]。
它是一种应用于监测环境致突变物对人体和其他生物体的遗传物质产生危害的技术,并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环境污染程度的相互关系,具有灵敏度高、操作简便等优点[4]。
该方法近年也逐渐应用于环境诱变剂的检测及致突变研究,是一种很好的致突变性分析的测试系统。
蚕豆根尖微核技术作为植物微核监测系统,已被广泛应用于环境诱变因子的研究,尤其是环境污染的监测[5]。
植物细胞微核、染色体畸变、有丝分裂指数等细胞遗传学指标被公认为是评价环境化学物质遗传性的有效方法之一,近年广泛应用于水生环境、工业排放物等的检测中[6]。
但近年来,受污染水体对不同的种子萌发的影响却少见报道。
为此本文研究了在其他因素相同的前提下,不同污水溶液与不同种子根尖细胞微核率的关系,以探明污水对种子萌发的影响情况,为科学开展治理农业问题提供一定参考资料。
蚕豆(Viciafaba)是经典的遗传学材料,蚕豆根尖细胞染色体较大,DNA含量较多,对诱变物反应敏感。
当蚕豆根尖细胞受到有毒理化物质和某些因素影响时,其细胞染色体的正常交换就会受到干扰,就有可能进一步发生畸变和断裂,形成染色体片段。
这些染色体片段分布在主核的周围就会形成微核[7]。
蚕豆微核实验被广泛应用于环境污染,辐射损伤,化学诱变剂等的检测。
我国从l985年开始研究应用蚕豆根尖微核技术直接检测淡水湖泊的水质状况,随着环境污染的日益严重,这一技术正被越来越多的研究者采用。
玉米(ZeamaysL.)是我国重要的小杂粮作物,由于其用途广泛,营养丰富,近年来已成为我国出口创汇和改善人民生活水平的重要作物之一。
玉米的染色体有两组,一共20条,而且其全部染色体都不显示着丝点带,但是由于其染色体较小,材料较少,给制片带来了很大的困难。
如果能够解决此难题,就能提高实验的准确性[8]。
运用蚕豆和玉米来研究具有广泛的意义。
1文献综述
1.1我国水污染的现状
我国水环境存在的主要问题之一就是水污染。
我国是一个水资源相对短缺的国家。
中国的水环境形势不容乐观,目前为止国内一些江河湖海的污染情况却依然十分严重,令人担忧。
随着工业化、城市化加快,世界面临着水资源短缺、污染严重的挑战。
中国尤其严重,是世界13个缺水国家之一,全国600多个城市中目前大约一半的城市缺水,水污染的恶化更使水短缺雪上加霜:
我国江河湖泊普遍遭受污染,全国75%的湖泊出现了不同程度的富营养化;
90%的城市水域污染严重,南方城市总缺水量60%-70%是由于水污染造成的;
对我国118个大中城市的地下水调查显示,有115个城市地下水受到污染,其中重度污染约占40%。
水污染降低了水体的使用功能,加剧了水资源短缺,对我国可持续发展战略的实施带来了负面影响。
我国水体污染主要来自两方面,一是工业发展超标排放工业废水,二是城市化中由于城市污水排放和集中处理设施严重缺乏,大量生活污水未经处理直接进入水体造成环境污染。
工业废水近年来经过治理虽有所减少,但城市生活污水有增无减,占水质污染的51%以上。
据环境部门监测,1999年全国近80%的生活污水未经处理直接进入江河湖海,年排污量达400亿立方米,造成全国三分之一以上水域受到污染。
1.2种子根尖细胞微核检测技术的研究进展
微核是染色体受到致畸物质损伤后发生断裂,在细胞分裂后期残留在细胞质中的一些无着丝粒断片,脱离主核而形成的。
微核的形态为椭圆形或圆形,直径小于主核的三分之一,嗜色性与主核一致,目前利用微核千分率作为检测某些物质是否具有致畸性或致癌性,以其检测环境被污染的程度的检测指标已被国际公认[9]。
微核是反映真核细胞遗传物质损伤的一个常用细胞遗传学指标,其检测程序具有快速、简便的特点,在环境污染检测和致突变性检测研究中得到广泛应用。
蚕豆根尖细胞微核技术(Vicia-micronucleustest,缩写为Vicia—MCN)自1982年由Te—HsiuMa和Francesca建立以来,目前已经在监测环境污染和检测危险化学品的实践当中得到广泛运用。
人们可以通过显微计数分析蚕豆根尖细胞的微核率情况,比较分析并且评估污染物质对生态环境的危害程度大小。
蚕豆根尖细胞微核技术是一种以染色体断裂及纺锤体损伤等为测试终点的植物微核检测方法,由于断裂后的片段不具着丝点,到细胞分裂末期,断片流失在细胞质中成为微核。
实验证明,环境诱变因子的强弱与诱发的微核率成正比,因此可用微核率大小来表示诱变因子的强弱。
利用蚕豆根尖细胞微核技术监测水质污染有以下优越性:
灵敏度高,可靠性强;
技术简单,易于操作,而且有显而易见的实用性;
实验周期短,且蚕豆根尖细胞周期中大部分时间处于对诱变剂敏感的间期,便于遗传毒性检测试验,精确度也比较高[10]。
微核试验方法产生于20世纪70年代,是一种快速检测细胞遗传学效应的方法。
自Matter和Sehmid利用啮齿动物骨髓细胞作为试验材料来测定有诱变活性的化合物以来,微核试验以其经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点,成为检测致突变剂和环境污染物等的快速初筛试验,目前许多国家和国际组织,已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理学安全性评价的必做实验。
由于试验材料和方法的不同,微核试验可进行体内研究和体外研究。
近年来,由于采用敏感动物试验的结果外推到人具有不确定性,饲养动物的环境设施、营养供给、动物福利要求高,耗资大;
以及自英国动物学家WilliamRussell和微生物学家RexBurch提出科学实验的“3R”原则(Reduction、Replacement、Refinement,减少、替代和优化)以来,体外微核技术得到了很大发展。
研究表明体外微核试验获得的微核率与体内实验显微镜检测有较好的一致性,在敏感性、特异性和准确性方面,与经典的染色体畸变分析方法基本相当。
经济合作与发展组织(OECD)正在进行体外微核试验准则的修订,准备将之引进OECD试验指南。
随着分子生物学技术的引进和自动化检测等研究的完善,体外微核技术不仅能检测细胞微核率,还能分析微核来源,并快速精确检测非整倍体。
欧洲替代试验有效性验证中心(ECVAM)正在研究以其替代染色体畸变试验,在不久的将来或许会替代小鼠骨髓嗜多染细胞微核试验[11]。
蚕豆根尖微核技术在环境监测中的应用越来越广泛,该检测方法被认为是致突变性分析的一种很好的测试系统[12]。
1982年,Hooftmand等使用基因毒剂处理淡水鱼类,观察到周围成熟红细胞的微核,认为这种异常能作为细胞遗传损伤的指示物,可用来检验在表面污染的水环境中基因毒剂的作用。
同年马德修利用美国紫露草为测试材料,建立了利用植物微核监测环境污染的新方法,我国在利用植物细胞微核监测环境污染方面的研究也开展较早。
目前,蚕豆根尖细胞微核试验是我国水环境监测的规范化方法之一。
1.3洗涤废水对种子萌发的研究进展
研究资料[13]表明洗涤废水浓度较高时,蚕豆的发芽和幼芽生长将会受到一定的抑制作用,并且浓度越大,抑制作用越强;
当洗涤废水浓度降低到较低浓度时,将会刺激蚕豆幼芽的生长发育,干物质质量增大。
Kovaeevi通过蚕豆根尖微核试验[14],总结出洗涤废水浓度与蚕豆根尖微核率的升高有明显剂量一效应关系。
洗涤废水中的有机污染物、酸性物质以及其他离子均可引起蚕豆根尖微核率的显著升高。
同时说明,蚕豆根尖微核率反映了洗涤废水中各种有害物质综合在一起的致突变性。
此外低浓度的洗涤废水可以引起蚕豆根尖细胞微核数量增加[15],影响蚕豆根尖细胞正常的染色体形成过程,但是却可以激发蚕豆幼苗的生物量增加。
这说明洗涤废水对蚕豆的生长过程的影响作用是一个复杂的过程,其更深层次的作用机理还有待深入研究。
并且,污水的酸碱度也会对种子的萌发造成不同程度的影响。
溶液的酸碱度(PH值)对蚕豆种子萌发生长具有重要的影响,发现了土壤溶液的酸碱度较大(PH为5)或较小(PH为9)时,种皮皱缩明显,种子萌发较快。
2实验部分
2.1水质分析
2.1.1水样来源
(1)污水
污水水样取于武昌工学院周边污水的生活污水。
(2)模拟洗涤废水
模拟洗涤废水为实验室自制,将10g洗衣粉溶解后于1000mL的容量瓶定容得洗衣粉含量为1%的A液,将A液稀释10倍得洗衣粉含量为0.1%的B液,将B液稀释10倍得洗衣服含量为0.01%的C液。
2.1.2水样主要物理指标的检测
COD测定重铬酸钾标准溶液滴法;
色度由视觉判断;
PH测定采用PH计测定(PHS一25型)物理指标检测结果见下表2.1。
表2.1污水的物理指标
水样类别
颜色
气味
是否有沉淀
PH
生活污水
浅灰色
有刺鼻的恶臭
放置一天后有少量沉淀
6.75
洗涤废水A
乳白色
有很浓的香味
放置半天后有少量白色沉淀
11.50
洗涤废水B
淡乳白色
有香味
9.88
洗涤废水C
无色
有很淡的香味
久置无沉淀
7.56
2.1.3生活污水COD的检测
(1)实验所需仪器设备
PHS一3CPH计(上海康仪仪器有限公司mg/L)。
回流装置24mm或29mm标准磨口500mL全玻璃回流装置。
加热装置电炉。
酸性滴定管50mL、25mL。
500mL锥形瓶。
(2)试剂
重铬酸钾标准溶液(1/6K2Cr2O7=0.2500mol/L)
试亚铁灵指示剂
硫酸亚铁铵标准溶液[(NH4)2Fe(SO4)2·
6H2O=0.1mol/L]
标定方法:
准确吸取10.00mL重铬酸钾标准溶液于500mL锥形瓶中,加水稀释至110mL左右,缓慢加入30mL浓硫酸,摇匀。
冷却后,加入3滴亚铁灵指示剂(约0.15mL),用硫酸亚铁铵溶液滴定到溶液的颜色由黄色经黄绿色至红褐色即为终点。
C[(NH4)2Fe(SO4)2]=0.2500×
10.00/V
式中:
c为硫酸亚铁铵标准溶液的浓度,moL/L;
V为硫酸亚铁铵标准滴定溶液的用量,mL。
硫酸-硫酸银溶液
硫酸汞结晶。
(3)步骤
取20.00mL混合均匀的水样(或适量水样稀释至20.00mL),至于500mL磨口锥形瓶中,加入0.4g硫酸汞和5mL浓硫酸,摇匀。
准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液,慢慢加入30mL硫酸-硫酸银溶液,轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀,加数粒玻璃球(以防爆沸),加热回流2h。
冷却后,先用少许水冲洗冷凝器,然后取下锥形瓶,用水稀释,总体积不得少于140mL,否则因酸度太大,滴定终点不明显。
溶液再度冷却后,加3滴亚铁灵指示剂,用硫酸亚铁铵标准溶液滴定,溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点,记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。
测定水样的同时,以20.00mL重蒸馏水作空白试验,其操作步骤和水样相同。
(4)计算
CODCr(O2,mg/L)=(V0-V1)×
c×
8×
1000/V
c为硫酸亚铁铵标准溶液的浓度,moL/L;
V为水样的体积,mL;
V0为滴定空白时硫酸亚铁铵溶液的用量,mL;
V1为滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的用量,mL;
8为1/2氧的摩尔质量,g/moL。
(5)实验结果
滴定空白时硫酸亚铁铵溶液的用量为24.2mL,即V0=22.4mL。
滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的用量为16mL,即V1=16mL。
所测得污水COD含量如下
CODCr(O2,mg/L)=(22.4-16)×
0.1×
1000/20
=256mg/L
COD(化学需氧量)是指在一定条件下,采用一定的强氧化剂处理水样时所消耗的氧化剂量。
它是水中还原性物质含量的一个指标各种有机物、亚硝酸盐、硫化物和亚铁盐,COD含量对水质造成严重的影响特别是污水中含有的COD值偏高,而且难去除,因为污水中COD含量的大小直接影响着水源的水质。
2.2蚕豆根尖细胞微核检测技术
2.2.1仪器设备
本实验所用仪器设备见表2.2
表2.2仪器设备
仪器名称
厂家
数量
电子分析天平
琴岛-利勃海尔冰箱
GXZ型智能光照恒温培养箱
CHA.213型显微镜
恒温水浴锅
北京赛多利斯天平有限公司
青岛海尔集团
宁波江南仪器厂
北京君意智德科技有限公司
上海普度生化科技有限公司
1台
2.2.2实验试剂
(1)消毒液(0.5%的NaCL)
(2)卡诺(carnoy)固定液(CH3CH2OH:
CH3C00H=3:
1)
(3)席夫(schiff)试剂染色液碱性品红0.2g,800C热蒸馏水100mL,溶解后冷却,过滤,加10%亚硫酸钠水溶液20mL。
再加硫酸2mL与适量蒸馏水,定容到200mL,试剂配置后放置1h以上脱色后方可应用。
(4)保存液(70%的C2H5OH)
(5)洗涤废水将10g洗衣粉溶解后于1000mL的容量瓶定容得洗衣粉含量为1%的A液,将A液稀释10倍得洗衣粉含量为0.1%的B液,将B液稀释10倍得洗衣服含量为0.01%的C液。
2.2.3实验材料
市售优质蚕豆和玉米种子,购于武汉市洪山区武泰闸粮油种子市场,污水为生活污水和模拟洗涤废水。
2.2.4实验过程
参考微核测定技术的相关文献【9】,确定实验流程为:
浸种催芽—染毒处理—测量—恢复培养—固定—材料保存—根尖处理—染色—压片观察。
(1)浸种催芽
选择饱满、大小均匀、无损伤的蚕豆种子和玉米种子,蒸馏水洗净后用0.5%的NaCl溶液消毒30min。
蒸馏水冲洗数次后(3~5次),放入盛有蒸馏水的培养皿中,置250C培养箱中无光培养20~30h,此间每12h换水一次。
待种子初生根露出2~3mm时,将种子移到底部铺有棉花的培养皿中催芽,种子上面盖两层润湿的纱布,于250C培养箱中培养36~48小时。
经催芽后种子大部分初生根发育良好,选取根长约1.00cm的种子进行染毒处理。
(2)染毒处理
选取14组生长良好,根尖长短、粗细一致的蚕豆种子,每10粒为一组进行编号1~14,其中1~9组用生活污水进行处理,10组用于做空白对照11~13组用洗涤废水进行处理,第11组用A液处理,第12组用B液处理,第13组用C液处理。
吸干表面水分,称鲜重,放入盛有受试物的培养皿中,使液体浸泡根尖,置250C恒温培养箱中培养24h。
同时用蒸馏水作空白对照。
同时选取10组较好的玉米种子,每组20粒,并用生活污水进行处理。
(3)恢复培养
将染毒处理后的种子用蒸馏水浸洗三次,每次2~3min,洗净后的种子放入新铺好棉花的培养皿内,于250C恒温培养箱,放在适度的培养条件使根尖下恢复培养24h。
(4)测量根长、芽长
恢复培养时间(24h)后,将培养皿中的种子取出,测量根和芽的长度,并计算平均值。
(5)根尖细胞固定
将恢复培养种子取出,切取长度约5mm的根尖。
先用蒸馏水冲洗根尖3~4次,再用改良Carnoy固定液在室温下固定20~24小时,其目的是为了迅速杀死根尖细胞,并使其保持原有状态。
然后用蒸馏水冲洗3~4次,转移至70%乙醇中于0~40C下保存备用。
(6)酸解染色
取出保存的根尖,用蒸馏水冲洗3~4次,加入1moL/LHCl,600C水解8~10min,直至根尖软化,洗去盐酸,用蒸馏水浸洗3次,每次l~2min。
在避光条件下用席夫(schiff)试剂浸泡染色2~3h,用量以淹没幼根后液面高出2mm为宜。
染色完成后除去染液,再用漂洗剂漂洗2次,每次5min,最后用蒸馏水漂洗5min。
(7)制片
将幼根放在擦净的载玻片上,截下1mm左右的根尖,滴一滴蒸馏水,加盖盖玻片。
再在盖玻片上加一小块滤纸,轻轻敲打压片。
(8)镜检
将制片先置于显微镜低倍镜下,找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂项较多的部位,再转到高倍镜(物镜×
10)下进行观察。
每组观察三个根尖,每个根尖观察1000个细胞,记录细胞数和微核数,并对有代表性的样本进行拍照。
在本实验室条件下,所配制的席夫(schiff)试剂染色液对玉米根尖染色效果很差,故无法在显微镜下观察玉米根尖细胞。
2.2.5检测指标
(1)萌发率:
培养3d后,观察萌发种子数(以胚芽长度大于lmm判为萌发);
(2)平均根长:
实验结束后用精度为0.1mm的尺子测量小麦主根根长,每组测量10株,求其平均值;
(3)平均芽长:
实验结束后用精度为0.1mm的尺子测量小麦芽长,每组测量10株,取平均值;
(4)微核千分率:
微核千分率(FMN)=微核数/1000个细胞。
2.2.6微核的判定
(1)凡小于主核1/4以下的,与主核有相同染色效果的物体;
(2)微核可以是圆形、椭圆形或其它类似的形状;
(3)微核同主核可以是相互紧靠一起,也可是相互分离的,但若是紧靠主核或在主核内部的微核,则必须是大于1/10主核;
2.2.7细胞与微核统计
(1)在40×
10(或16)显微镜下识别微核并计数,细胞可采用直接计数或从每镜头约多少细胞进行估数;
(2)每一细胞可能会出现单微核、双微核及多微核等情况可列表计数;
(3)每一组取较好的5张片镜检,每张片至少计1000个细胞。
3实验结果及分析
3.1生活污水和洗涤废水对蚕豆种子萌发率的影响
实验结果见表3.1。
表3.1生活污水对蚕豆种子萌发率的影响
组别
种子数
种子萌发数
种子萌发率
1
2
3
4
5
6
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