谷氨酸发酵Word文件下载.docx

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⏹整个过程可简单的分为2个阶段:

Ø

第1阶段是菌体生长阶段;

第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。

三、合成谷氨酸的生化途径

（一）、GA的生物合成途径

⏹主要有：

Glucose的酵解，EMP

Glucose的有氧氧化，HMP

丙酮酸的有氧氧化，TCA循环

乙醛酸循环途径，DCA循环

CO2固定反应

α-酮戊二酸（α-KGA）的还原氨基化

⏹这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：

（二）、GA生物合成的内在因素

⏹从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：

谷氨酸生产菌的生化特征—内在因素

⏹1生物素缺陷型

⏹谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量（贫乏量）,引起菌种代谢失调,使谷氨酸得到大量积累。

⏹2具有CO2固定反应的酶系

⏹菌种能利用CO2产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸的大量积累。

3.α-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失

⏹这是菌体生成并积累α-KGA的关键，从上图可以看出，α-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。

只有当体内α-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。

4.GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失

⏹1）如上图所示，NADPH是α-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。

⏹

（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α-KGA的脱羧氧化有一定的意义。

5.产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶

⏹该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。

糖的代谢才能沿着α-酮戊二酸的方向进行,从而有利于谷氨酸的积累。

6.菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性

⏹α-KGA+NH4++NADPH==GA+NADP

（NADH:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

NADPH:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）

⏹L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，α-酮戊二酸易生成谷氨酸。

⏹该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：

⏹偶联反应

α-KGANADPHα-KGA

GANADP异柠檬酸

CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。

提高GA的潜力

⏹1）强化CO2固定反应，具体措施：

Mn+，生物素.

⏹

（2）控制溶氧浓度是非常重要的

⏹低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化……

⏹高的溶氧浓度，则NADPH有被氧化的可能，……

（五）GA发酵的外在因素

⏹GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性。

⏹但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。

1.供氧浓度

⏹过量：

NADPH的再氧化能力会加强，使α-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA的生成。

⏹供氧不足：

积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。

2.NH4+浓度

⏹

（1）影响到发酵液的pH值

⏹

（2）与产物的形成有关：

⏹NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨酰胺（Gln）

⏹NH4+不足，不利于α-KGA的还原氨基化，-酮戊二酸积累，引起反馈调节

NH4+与产物的形成

3.磷酸盐

⏹

（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等……

⏹

（2）产生并积累缬氨酸（Val）

环境条件

4.发酵液的碳氮比

⏹发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。

在一定范围内,谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加,但糖含量过高,渗透压过大,对菌体生长不利,谷氨酸对糖的转化率低。

⏹发酵液中还原糖的含量一般应控制在10%～13%。

⏹氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。

⏹谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：

0.2-2.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：

15-21。

⏹在谷氨酸发酵过程中,应正确控制碳氮比。

一般在菌体生长期碳氮比应大一些（氮低）,在产酸期,碳氮比应小些（氮高）。

在碳源和氮源的比为3∶1时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为4∶1时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。

5.生物素

⏹谷氨酸产生菌是营养缺陷型,对生长繁殖、代谢产物的影响非常明显。

⏹当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸,同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成,使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%;

⏹生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累,发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。

因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。

6.发酵温度

⏹谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即30～32℃。

温度过低,菌体生长繁殖慢;

若温度过高,菌体易衰老,生产中表现为DO值增长慢,耗糖慢,pH值高,最终发酵周期长,产酸少。

⏹发酵中、后期菌体生长基本停止,为积累大量谷氨酸,应适当提高发酵温度,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。

7.pH值

⏹1）pH值对谷氨酸产生菌生长的影响

⏹谷氨酸产生菌象其它微生物一样,有最适生长pH值范围,当高于或低于这个值时:

（1）菌体内的酶受到抑制,菌体新陈代谢受阻,生长停滞;

（2）菌体细胞膜所带电荷发生改变,从而改变细胞膜的渗透性,影响菌体对营养的吸收和代谢产物的排出;

（3）影响培养基组分和中间代谢产物的离解,从而影响菌体对这些物质的利用。

⏹2）pH值对谷氨酸积累的影响

⏹谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适pH为7.0～7.2,当发酵液的pH值偏酸时（pH5.0-5.8）,谷氨酸脱氢酶受到抑制,代谢向着生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。

⏹在发酵后期由于耗用大量NH4+,pH值下降,此时就要进行pH值调节,以保证发酵的正常进行。

⏹pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。

⏹如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸时，培养液的pH就会下降。

而碱性物质的消耗和氨的生成等则会导致培养液的pH上升。

pH：

前期pH（7.5-8.0），中后期pH7.0-7.6。

通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。

8.通风（同1.供氧浓度）

⏹通风的实质就是供氧并使菌体和培养基充分混合。

谷氨酸产生菌为兼性好氧菌,在有氧、无氧的条件下都能生长,只是其代谢产物不同。

在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。

⏹风量过大,氧气充足,在长菌阶段表现为耗糖慢,菌体生长慢,pH值偏高,产酸阶段,供氢体被氧化,谷氨酸合成受阻,积累α-酮戊二酸;

⏹风量小,供氧不足,长菌阶段表现为菌体生长快,在产酸阶段,葡萄糖进入菌体后,进行不完全氧化,产物由谷氨酸变为乳酸。

9.泡沫

谷氨酸发酵是好气性发酵,因通风和搅拌产生泡沫是正常的,但泡沫过多会带来一系列问题:

（1）泡沫形成泡盖时,代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢;

（2）泡沫过多,发酵液会外溢,造成浪费和污染;

（3）泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。

因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。

谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系

⏹谷氨酸发酵过程中,生产菌种的特性、生长素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。

在实际生产中,只有针对存在的问题,严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。

⏹假设人们想利用葡萄糖、谷氨酸棒状杆菌生产α-酮戊二酸，请你利用现有知识，如何设计一个大量积累α-酮戊二酸的方案?

⏹菌种：

对谷氨酸捧状杆菌进行诱变处理，选育不能合成谷氨酸脱氢酶的菌种

⏹条件：

氧（通风）、NH4+、C/N；

pH、磷酸盐、温度、生物素、Mn+

代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用

（一）遗传学方法

2抗反馈控制突变株的应用

3选育组成型突变株和超产突变株

（二）生物化学方法

（三）控制细胞膜渗透性

四、 

谷氨酸发酵 

1） 

谷氨酸生产菌 

⏹谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌。

⏹我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6-13等。

生产菌株特点

在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同特点:

⏹革兰氏阳性

⏹菌体为球形、短杆至棒状

⏹不形成芽孢

⏹没有鞭毛，不能运动

⏹需要生物素作为生长因子

⏹在通气条件下才能产生谷氨酸。

2） 

生产原料

发酵生产谷氨酸的原料有

⏹淀粉质原料：

玉米、小麦、甘薯、大米等。

其中甘薯和淀粉最为常用；

⏹大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，过滤后可供配制培养基。

⏹糖蜜原料：

甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；

不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。

⏹预处理方法：

活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。

也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。

⏹氮源料：

尿素或氨水。

3）工艺流程

味精生产全过程可分五个部分：

⏹原料的预处理及淀粉水解糖的制取；

⏹谷氨酸生产菌种子的扩大培养；

⏹谷氨酸发酵；

⏹谷氨酸的提取与分离；

⏹由谷氨酸制成味精及味精成品加工。

⏹味精生产的主要原材料为淀粉

⏹辅助材料包括硫酸、液氨、碳酸钠、 

活性碳、液碱、盐、消泡剂、淀粉酶等

⏹年产12万吨味精，主要原辅材料耗用如下表：

项 

目 

单位：

吨

淀 

粉 

196,870

液 

氨 

31,108

硫 

酸 

35,000

碳酸钠 

30,000

活性碳 

2,500

碱 

40,000

盐 

8,000

消泡剂 

77,960

淀粉酶 

11,694

4） 

发酵生产工艺 

①培养基成分

⏹碳源：

碳源是构成菌体和合成谷氨酸的碳架及能量的来源。

⏹谷氨酸产生菌是异养微生物，只能从有机物中获得碳素，细胞进行合成反应所需要能量也是从氧化分解有机物过程中得到的。

⏹实际生产中以糖质原料为主。

培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有密切的关系。

在一定的范围内，谷氨酸产量随糖浓度的增加而增加。

⏹氮源：

氮源是合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料。

碳氮比对谷氨酸发酵有很大影响。

大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。

⏹无机盐：

是微生物维持生命活动不可缺少的物质。

⏹主要功能：

构成细胞的组成成分；

作为酶的组成成分；

激活或抑制酶的活力；

调节培养基的渗透压；

调节培养基的pH；

调节培养基的氧化还原电位。

起着调节微生物生命活动的作用。

发酵时，使用的无机离子有K+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等阳离子和PO43-、SO42-、Cl－等阴离子，其用量如下：

⏹生物素：

凡是微生物生命活动不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有机物质都称为生长因子。

生长因子通常是指氨基酸、嘌呤、嘧啶和B族维生素的一种，生物素又叫维生素H或辅酶R。

⏹糖质为碳源的谷氨酸产生菌几乎都是生物素缺陷型，这些细菌本身都不能合成生物素。

生物素的作用是影响代谢途径；

影响细胞的渗透性。

⏹生长因子含量的多少，与生产有着十分密切的关系。

实际生产中通过添加玉米浆、麸皮水解液、糖蜜等作为生长因子的来源，来满足谷氨酸产生菌必须的生长因子。

② 

培养基 

a 

斜面培养基 

⏹葡萄糖 

0.1%、牛肉膏 

1.0%、 

蛋白胨 

1.0%、氯化钠 

0.5%、琼脂 

2.0%、pH 

7.0~7.2

⏹121℃灭菌30min

⏹32℃培养18-24h

（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。

b 

一级种子、二级种子及发酵培养基 

⏹一级种子 

葡萄糖 

2.5%、尿素 

0.6%、KH2PO4 

0.1%、MgSO4.7H2O 

0.04%、玉米浆 

2.3-3.0ml、pH 

7.0,1000ml装200-250ml振荡，32℃培养12h。

⏹二级种子 

水解糖 

3.0%、尿素 

0.6%、玉米浆 

0.5-0.6ml、K2HPO4 

0.1-0.2%、MgSO4.7H2O 

0.04%、pH 

7.0,呈单个或八字排列。

活菌数为108-109/ml。

⏹发酵培养基 

水解糖12-14%、尿素 

0.5-0.8%、玉米浆 

0.6ml、MgSO4.7H2O 

0.06%、KCl 

0.05%、Na2HPO4 

0.17%、pH 

7.0 

③ 

发酵条件的控制 

温度

⏹谷氨酸发酵前期（0-12h）是菌体大量繁殖阶段，在此阶段菌体利用培养基中的营养物质来合成核酸、蛋白质等，供菌体繁殖用，而控制这些合成反应的最适温度均在30~32℃。

⏹对数生长期：

糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。

溶氧急剧下降后维持在一定水平。

菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。

不产酸。

12h。

⏹措施：

及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；

⏹在发酵中、后期，是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在32~36℃，故发酵中、后期适当提高罐温对积累谷氨酸有利。

pH值

⏹发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。

⏹发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；

如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。

⏹在发酵前期将pH值控制在7.5-8.0左右较为合适，而在发酵中、后期将pH值控制在7.0-7.6左右对提高谷氨酸产量有利。

c 

通风

⏹在谷氨酸发酵过程中，发酵前期以低通风量为宜；

发酵中、后期以高通风量为宜。

⏹实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。

另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。

d 

泡沫的控制

⏹在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸和代谢。

给发酵带来危害，必须加以消泡。

⏹消泡方法有机械消泡（耙式、离心式、刮板式、蝶式消泡器）和化学消泡（天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等化学消泡剂）两种方法。

e 

发酵时间

⏹不同的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一样，其发酵时间也有所差异。

⏹低糖（10%-12%）发酵，其发酵时间为36-38h，

⏹中糖（14%）发酵，其发酵时间为45h。

谷氨酸发酵例子

⏹某谷氨酸发酵，发酵过程中各种参数的变化情况如图所示。

最后的发酵液中谷氨酸的浓度很低，发酵周期较长，而这段时间却有大量的葡萄糖被消耗，那么，这些被消耗的葡萄糖到哪里去了？

⏹如以上两种情况都不是，发酵过程中出现了这种异常情况，还有什么原因呢？

⏹须根据发酵过程中其他参数如溶氧浓度的变化，结合菌体形态观察等进一步分析，是由于发酵用培养基中添加的玉米浆过量，导致生物素浓度过高，这样菌体不能顺利地实现从生长型到产物积累型的转变，因而出现了这种在工业生产上称之为“只长菌，不产酸”的发酵异常现象。

五、谷氨酸提取工艺

①等电点法提取操作简单，收率60％。

周期长，占地面积大

⏹等电点法提取谷氨酸原理

⏹谷氨酸：

α-型斜方晶体（好），β-型鳞片状晶体；

α型结晶水分在5～10%,而β型结晶水分则高达15～20%。

生产上应防止β型晶体的生成。

⏹注意三个方面

⏹A、发酵液纯度高：

谷氨酸/残糖比值高，胶体少，提前除菌体最好；

⏹B、发酵液处理要及时；

⏹C、加酸调pH、温度、育晶时间、搅拌服从结晶规律。

等电点法提取谷氨酸原理

⏹谷氨酸在等电点时,绝大部分以偶极离子（GA±

）状态存在,其分子内部正负电荷相等,并含有等量的带不同电荷的阳离子（GA+）和阴离子（GA-）,因此溶液中总静电荷等于零。

由于谷氨酸分子之间相互碰撞,再通过静电引力的作用,结合成较大的聚合体而被沉淀析出,因而处于等电点时GA的溶解度最小。

又由于温度对GA的溶解度影响很大,温度越低溶解度越小,生产上多采用0～4℃。

这就是工业粗提味精所用的等电点法提取谷氨酸原理

⏹等电点时谷氨酸四种离子方式在水溶液中所占的比例

⏹GA+:

7.861%,GA±

:

84.24%,

GA-:

7.861%,GA=:

0.2789×

10-5%

离子交换法提取GA的原理

⏹离子交换法提取GA的原理当氨基酸pH值大于3.22时羧基离解而带负电,它能被阴离子交换树脂吸附;

当pH小于3.22时氨基离解而带正电,此时能被阳离子交换树脂吸附。

⏹离子交换法提取GA是利用阳离子交换树脂对GA阳离子的选择性吸附,以使发酵液中阻碍GA结晶的残糖及糖的聚合物、蛋白质、色素等非离子性杂质得以分离,然后经洗脱达到浓缩提取GA的目的。

②离子交换法提取

⏹发酵液→稀释并调pH5.0-5.5?

→上柱→732#阳离子（H型）交换→70℃水洗*（正或反洗）→60℃4%NaOH液正洗脱→高流分收集→调pH3.2→结晶→离心分离→谷氨酸

⏹树脂：

苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂732#、730#和甲基丙烯酸弱酸型阳离子交换树脂。

⏹树脂处理：

柱→水洗（正和反洗）→5.4%HCl再生→水洗

⏹水洗*:

洗脱粘附于树脂表面的菌体、胶体,并疏松树脂

⏹料液中不仅有GA，还有NH4+和其他金属离子;

阳离子交换树脂对NH4+和其他金属离子的亲和力大于对谷氨酸的亲和力。

上柱时NH4+和其他金属离子先发生交换，把H+置换下来，液体pH降低，使主要以GA+形式存在，随后GA+发生交换。

⏹水洗*目的:

⏹温柱，防止GA在柱中结晶析出产生“结柱”

⏹预热树脂，避免热碱液聚热发生破碎

⏹采用NaOH洗脱剂洗脱时,由于谷氨酸在树脂内部较为集中,NaOH浓度不能太高,温度又不能太低。

一般以4%的浓度,60～70℃的温度洗脱较好,否则将产生“结柱”。

⏹离子交换收集液的低（初）流分可以上柱再交换；

⏹高流分收集→调pH3.2→结晶；

⏹后流分单独上离子交换柱进行回收。

谷氨酸解离常数和等电点

以GA+、GA±

、GA-、GA=等四种离子方式存在

⏹离子交换法提取谷氮酸是以其两性解离为基础．在酸性条件下（pH<

3．2）谷氨酸以阳离子状态存在，可以采用阳离子交换树脂来提取

⏹菌体含量较高，多采用料液从离子交换柱下部进入的反上柱带菌操作

⏹上柱量计算公式

③影响结晶的主要因素

创造一定的过饱和度

⏹控制加酸的速度，不能太快，避免形成大量晶核；

⏹晶粒形成温度30-25℃，不能高于30℃，温度不能回升，控制酸的流加速度来防止回升。

⏹添加α型晶种：

0.2%-0.3%。

谷氨酸含量5%以上，pH4.5-4.0时投种；

谷氨酸含量4%-5%时pH4.0时投种。

pH影响溶液溶解度,使溶液中过饱和度合适

⏹