T载体与目的基因连接之欧阳体创编Word文档格式.docx
- 文档编号:22654041
- 上传时间:2023-02-05
- 格式:DOCX
- 页数:7
- 大小:19.59KB
T载体与目的基因连接之欧阳体创编Word文档格式.docx
《T载体与目的基因连接之欧阳体创编Word文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《T载体与目的基因连接之欧阳体创编Word文档格式.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCmT载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样,pUCmT载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCmT载体中,形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度,即1216℃,连接1216h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二.感受态制备原理
细菌在0°
CCaCl2低渗溶液中胀成球形,丢失部分膜蛋白,成为容易吸收外源DNA的感受态。
三.β半乳糖甘酶显色反应选择法
LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,可以编码β—半乳糖核苷酶。
β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体,可催化乳糖的水解.用XGal为底物进行染色时,呈蓝色。
现在一些特定的质粒(比如pUC/pBS等),常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸(α肽段)的编码序列,在这个编码序列里还插入一个多克隆位点(MCS),它并不影响lacZ的表达。
另外,常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段),的编码序列。
在各自独立的情况下,这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。
只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞,在培养基诱导物IPTG的诱导下,载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端(α肽段),这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段)互补,形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后,会造成lacZ基因不能表达,从而不能合成β—半乳糖核苷酶;
而对于空载体,lacZ基因正常表达,通过α互补合成β—半乳糖核苷酶,分解培养基里的色素底物Xgal,最终形成蓝色的化合物,出现蓝色菌斑。
实验准备:
清洗,5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒。
准备100ml超纯水。
溶液:
LB300ml(液体50ml+50ml,固体100ml),0.1mol/LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,20mg/mlXgal1ml,200mg/mlIPTG1ml。
大肠杆菌菌液1ml。
感受态细胞
连接产物
4管
4x5=20ul做4份
目的基因
T载体
T4连接酶
10x冲液
4x4uL
4x1uL
4x0.5uL
灭菌:
5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒,10ml超纯水,LB培养基,1.5mlEP管,大小枪头,过滤用具2副,,0.1mol/LCaCl2
实际配置20mg/mlXgalXgal为5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷。
用二基甲酰胺(DMF)溶解Xgal配制成的20mg/ml(取0.02gXgal,用DMF定容为1ml)的贮存液。
保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有Xgal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于20℃。
Xgal溶液无须过滤除菌。
(DMF二甲基甲酰胺;
Dimethylformamide;
N,NDimethylformamide;
DMF;
CAS:
68122 理化性质:
无色、淡的胺味的液体。
分子式C3H7NO。
分子量73.10。
相对密度0.9445(25℃)。
熔点61℃。
沸点152.8℃。
)溶于DMSO,溶解度可达20mg/ml。
也溶于DMF溶于DMSO,溶解度可达20mg/ml。
也溶于DMF
200mg/mlIPTG在0.8ml蒸馏水中溶解0.2gIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤器过滤除菌,贮存于20℃。
LB培养基:
配制每升培养基,应该在950ml去离子水中加入:
胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.(100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固体培养基)
0.1mol/LCaCl2:
取0.11098g氯化钙固体定容至10ml
Amp(100mg/ml):
溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最后定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌.
实验过程
(一).目的基因片段与载体连接
器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml微量离心管,双面离心管架,台式离心机,干式恒温气浴。
试剂
T载体,T4DNA连接酶,连接酶缓冲液,无菌ddWater。
操作步骤
PCR产物与T载体直接连接:
(1)事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在14~16°
C。
(2)取4个灭菌的200ul微量离心管,加入:
(需要调整)4ml目的基因;
1mlT载体;
0.5mlT4DNA连接酶(TAKARA,350U/ul);
1ml连接酶缓冲液10xbuffer;
3.5mlddWater,总量10ml体系。
(3)述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于14°
C干式恒温仪(或14°
C水中)中保温过夜(1216h)。
(4)连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°
C冰箱备用。
(二).大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
仪器:
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml微量离心管,1.5ml微量离心管,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LBAmp),酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱,滤膜和过滤器
试剂:
E.coli菌种,LB培养基,0.1mol/LCaCl2溶液,无菌ddWater,LB培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddwater,IPTG,Xgal。
步骤
(1)在超净工作台中,将1ml大肠杆菌菌液加入100mlLB液态培养基(不含抗菌素),37℃摇床培养过夜。
(2)取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中,37℃下250r/min摇床培养2~3h,测定OD590为0.35~0.4左右(<
0.4~0.6,细胞数<
108/mL,此为关键参数!
)。
(注意:
此步摇菌的时候,要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌)
(3)将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中,于冰上放置10min,然后于4℃,5000rpm离心5min。
(4)将离心管倒置以倒尽上清液,加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液,立即在涡旋混合器上混匀,插入冰中放置30min。
(5)4℃,5000rpm离心5min,弃上清液后,用100μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬,插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验,或立即放入4摄氏度冰柜中保藏。
(6)事先将恒温水浴的温度调到42℃。
(7)从70℃超低温冰柜中取出一管(100μL)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min。
(8)加入5μL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。
(9)轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3min。
(10)在超净工作台中向上述各管中分别加入300μLLB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
(11)在超净工作台中取上述转化混合液200μL,分别滴到含合适抗菌素(Amp100ug/L)的固体LB平板培养皿中,再在平板上滴加40μL20mg/mlXgal,7μL200mg/mlIPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:
一个不含抗生素作为对照组,玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂,菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。
(12)在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
(13)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面。
(14)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。
注意白色菌斑。
(三).转化克隆的筛选和鉴定
器材旋涡混合器,小镊子,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml微量离心管,双面离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,超净工作台,酒精灯,无菌牙签,摇菌管。
试剂LB培养基(加抗菌素),PCR用试剂,引物,质粒提取用试剂,酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液,65%甘油(65%甘油,0.1mol/LMgSO4,0.025mol/LTrisClpH8.0)。
操作步骤方法一:
快速PCR筛选法
(1)在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落,并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
(2)在0.2mlPCR微量离心管中配制25μl反应体系。
ddwater16μl
10×
PCRbuffer(不含MgCl2)2.5μl
25mMMgCl21.5μl
2.5mmol/LdNTP2μl(每种dNTP终浓度0.2mM)
10μmol/LPrimer11μl(12.5—25pmoles)
10μmol/Lprimer21μl(12.5—25pmoles)
模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落,再伸入PCR混合液中洗一洗
Taq酶0.5μl(1.5u)
总体积25μl
(2)根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序(本实验室已经设置为WZ):
①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10min
(2)PCR结束后,取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳(与原始插入片断同时比对)。
观察胶上是否有预计的主要产物带。
(3)按照编号找到培养皿中的原菌斑。
根据需要进行放大培养提取其质粒
(4)提取到的质粒与原先的空载体(或已知分子量的质粒)再对比电泳,以进一步确认。
方法二:
提质粒再PCR或酶切鉴定
(1)在超净工作台中取3支无菌摇菌管,各加入3mLLB(含50mg/mL氨苄青霉素),用记号笔写好编号。
(2)在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过,镊取一支无菌牙签。
用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落,然后将牙签放入盛有3mLLB(含50mg/mL氨苄青霉素)的摇菌管中。
用此法随机取3个白色菌落,分别装入3个摇菌管中。
(3)37℃摇菌过夜后,用碱裂解法分别提取质粒。
摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
(4)提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增,或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断(方法见有关实验)。
(5)将经过鉴定判断为正确的质粒保存。
按照编号找到冰箱中原菌液。
根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达,或取500mL菌液与500mL65%甘油混合后80℃保存。
(6)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 载体 目的 基因 连接 欧阳 创编