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【关键词】血管内皮生长因子;
缺血再灌注损伤;
胰腺
Abstract:
Objective:
Toexploretheexpressionandsignificanceofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inischemiareperfusioninjury(IRI)ofthepancreas.Methods:
ThirtytwomaleSDratswererandomlydividedintofourgroups(n=8).GroupAservedascontrolgroup,GroupsB,CandDweresubjected15mins,30minsand60minsofischemiarespectivelybyclampingofceliacarteryandsuperiormesentericartery,thenreleasedfor6hourstoproduceischemiareperfusioninjurymodel.Ratsweresacrificedandthepancreaswasremovedforhistologicalinjuryevaluationanddetectionofwet/dryweightratioandimmunohistochemicalstainingofVEGF.Results:
TheexpressionofVEGFinpancreasincreasedafterischemiareperfusioninjury.TherewasdifferentialexpressionofVEGFamongtheisletcells,stromalvascularepithelialcells,acinarandductepithelialcellsofpancreas().Pathologicalscoreandwet/dryweightratioofthepancreaswerecorrelatedpositivelywiththescoreofimmunohistochemicalstainingofVEGFintheisletcells()andshowedahighpositivecorrelationwiththatinstromalvascularepithelialcells().Conclusion:
TheedemaofthepancreascausedbyischemiareperfusioninjurymayberelatedtotheincreasedexpressionofVEGF.
Keywords:
vascularendothelialgrowthfactor;
ischemia/reperfusioninjury;
pancreas
缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI)是引起胰腺移植后早期功能丧失的主要原因之一。
研究发现血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)与胰腺IRI有关[1]。
本研究通过钳闭大鼠腹腔干和肠系膜上动脉建立大鼠胰腺IRI模型,对VEGF在胰腺IRI中的作用进行研究,现将结果报告如下。
1材料和方法
动物和试剂清洁级健康雄性SD大鼠,体重(230士25)g,由温州医学院实验动物中心提供;
VEGF多克隆抗体为LabvisionNeoMarkers公司的产品,免疫组化检测试剂盒为丹麦DAKO公司产品。
实验分组和动物模型32只SD大鼠,用随机数字法分为A组、B组、C组和D组,每组各8只。
动物于实验前12h禁食,不禁水。
戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉。
其中B组、C组和D组分别用血管夹阻断大鼠腹腔干及肠系膜上动脉15、30和60min,然后再灌注6h,脊椎脱臼法处死大鼠,取胰腺组织标本;
A组为对照组,仅解剖显露大鼠腹腔干及肠系膜上动脉,6h后取胰腺组织标本。
观察指标和检测方法①胰腺组织标本分成两份,其中一份用电子分析天平称湿重,置90℃电热干燥箱内烘烤72h后再称干重,并计算胰腺湿/干质量比(W/D)。
另一份用10%中性福尔马林磷酸缓冲液4℃固定24h,石蜡包埋切片。
②胰腺切片常规行苏木素-伊红染色。
采用双盲法由病理科医师在光镜下观察胰腺病理变化,根据胰腺病理评分标准对胰腺组织损伤程度进行评分。
③采用免疫组织化学方法检测胰腺组织VEGF蛋白表达情况。
每张切片随机检查10个高倍视野,按阳性细胞计数分值和染色强度分值的乘积记分。
其中,阳性细胞数计分为:
0(≤5%);
1(5%~25%);
2(25%~50%);
3(50%~75%);
4(≥75%)。
染色强度计分为:
1(弱阳性);
2(中度阳性);
3(强阳性)。
统计学处理方法胰腺组织的病理评分、VEGF染色评分及湿干质量比(W/D)比较用方差分析,组间均数的两两比较方差齐用LSD检验,方差不齐用Dunnett’sT3检验。
VEGF染色评分与病理评分、湿干质量比(W/D)的相关性检验采用Pearson法。
2结果
光镜下病理变化A组:
胰腺细胞形态结构正常,未见炎性细胞浸润。
B组:
见胰腺细胞轻度肿胀,间质轻度水肿,无明显细胞结构破坏及炎性细胞浸润。
C组:
见胰腺细胞肿胀明显,空泡变性,胰腺间质、被膜下明显水肿,血管充血、红细胞溢出,可见炎性细胞浸润,未见坏死细胞。
D组:
见胰腺组织局灶性坏死,间质出血明显,大量炎性细胞浸润,见图1。
胰腺组织病理评分各组间两两比较差异均有显着性(均),见表1。
胰腺组织W/D比值IRI胰腺组织的W/D比值随着缺血时间延长而增大,除B组与A组相比较差异无显着性()外,各组间相互两两比较差异均有显着性(均),见表1。
VEGF免疫组化VEGF表达阳性细胞胞浆被染成黄色或棕黄色,呈点状或团块状分布。
对照组(A组)胰腺组织的VEGF蛋白表达可见于胰岛细胞及导管上皮细胞,胰岛细胞免疫组化染色呈中度阳性,导管上皮细胞为弱阳性,腺泡细胞及间质血管内皮细胞呈阴性。
缺血/再灌注损伤组(B组、C组和D组)胰腺组织VEGF蛋白阳性表达位于胰岛细胞、间质血管内皮细胞、腺泡及导管上皮细胞,见图2。
VEGF蛋白表达在胰岛细胞、间质血管内皮细胞、腺泡及导管上皮细胞之间存在差异()。
腺泡及导管上皮细胞的VEGF免疫组化染色B组和D组呈弱阳性,而C组呈中度阳性表达,其免疫组化染色评分各组间两两比较除B组和D组之间差异无显着性()外差异均有显着性()。
胰岛细胞VEGF免疫组化染色B组、C组和D组均呈强阳性,其免疫组化染色评分B组、C组和D组间两两比较差异均无显着性(均),B组、C组、D组与A组比较差异均有显着性(均)。
间质血管内皮细胞的VEGF免疫组化染色随缺血时间的延长而加深,其中B组为弱阳性,C组为中度阳性,D组为强阳性;
其免疫组化染色评分各组间两两比较差异均有显着性(均)。
VEGF免疫组化染色评分见表2。
VEGF蛋白表达与胰腺病理变化的关系胰腺腺泡及导管上皮细胞的VEGF免疫组化染色评分与胰腺病理评分无相关性(r=,,n=32),与胰腺W/D比值无相关性(r=,,n=32);
胰岛细胞的VEGF免疫组化染色评分与胰腺病理评分呈正相关(r=,,n=32),与胰腺W/D比值呈正相关(r=,,n=32);
间质血管内皮细胞VEGF免疫组化染色评分与胰腺病理评分呈高度正相关(r=,,n=32),与胰腺W/D比值呈高度正相关(r=,,n=32)。
3讨论
胰腺组织的短暂缺血是胰腺移植过程中的必经阶段,移植胰腺恢复血流灌注和氧供后常使其遭受到难以避免的缺血再灌注损伤。
缺血再灌注损伤可导致胰腺组织微血管通透性显着增加,大分子物质尤其是血浆蛋白及其伴随的大量水分进入组织间隙,组织出现明显水肿,胰腺组织的水肿会进一步加重其微循环障碍,从而影响移植胰腺的功能。
微血管通透性改变的原因及机制复杂,还未完全阐明。
组织缺血再灌注时可造成细胞能量代谢障碍、细胞内钙超载、大量氧自由产生及一些细胞因子的表达增加。
大量的氧自由基可引发细胞膜的脂质过氧化;
细胞内钙超载可激活磷脂酶,使膜磷脂降解;
缺血后一些细胞因子如TNF-α,IL-1β等的表达急剧增加,TNF-α,IL-1β不但可直接作用于细胞,使其溶解,而且可对中性粒细胞起趋化作用并使其脱颗粒,释放各种蛋白水解酶,以上这些因素均可造成血管内皮的损伤及功能异常,导致微血管通透性增加。
除此之外,有研究表明VEGF在胰腺缺血再灌注损伤过程中可能对微血管通透性增加起重要作用[1]。
VEGF是一类能够与血管内皮细胞表面特异性受体结合来发挥生物学作用的血管生长调控因子。
VEGF在正常人体中含量低,而在胚胎发育、创伤愈合、组织缺血或低氧、肿瘤的发生与转移等过程中呈高水平表达。
VEGF的生物学功能主要有:
①增加血管通透性;
②诱导血管生成。
VEGF对微血管通透性具有特异性的作用,故其又被称作血管渗透性因子。
VEGF的增加血管通透性作用比组胺强5万倍,是已知最强的血管通透剂。
VEGF引起微血管通透性增加的机制在于激活血管内皮细胞胞浆中跨内皮转运的囊泡(vesicularvacu-olarorganelles)。
据研究报道,卵巢过度刺激综合征的胸腹水、瘤周水肿、高原脑水肿的形成可能与VEGF增加血管通透性有关[6-8]。
为了了解VEGF在胰腺缺血再灌注损伤中表达的情况及其对胰腺病理变化的影响,本实验采用血管夹阻断大鼠腹腔干及肠系膜上动脉成功建立胰腺缺血再灌注损伤模型,通过对缺血再灌注损伤胰腺的VEGF蛋白表达进行免疫组化研究发现:
经缺血再灌注后,胰腺组织的VEGF蛋白表达增强,VEGF蛋白表达在胰腺的胰岛细胞、间质血管内皮细胞、腺泡及导管上皮细胞之间存在差异。
腺泡及导管上皮细胞的VEGF蛋白表达在缺血30min再灌注6h组最强,呈中度阳性表达,延长缺血时间VEGF蛋白表达明显减弱。
胰岛细胞的VEGF蛋白表达在对照组即呈中度阳性表达,在缺血再灌注各组均呈强阳性表达。
胰腺间质血管内皮细胞的VEGF蛋白表达随缺血时间的延长而增强,缺血60min再灌注6h组血管内皮细胞的VEGF蛋白呈强阳性表达。
胰腺病理评分和W/D比值与胰岛细胞的VEGF免疫组化染色评分呈正相关,与间质血管内皮细胞的VEGF免疫组化染色评分呈高度正相关,提示胰腺IRI引起的胰腺水肿可能与VEGF表达增强有关。
对VEGF蛋白表达进行调控有可能减轻胰腺组织水肿,改善胰腺微循环,预防移植胰腺的功能丧失。
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