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整理讲义1
实验九从红藻中制取琼胶和琼酯糖提取
一、目的要求
1.熟悉从红藻提取琼胶的生产工艺和方法;
2.了解琼胶的用途和产品的质量标准;
3.熟悉从琼胶提取琼胶素的方法;
4.掌握蒽酮法测定碳水化学物的方法。
二、方法概述
浩瀚无垠的海洋,孕育着无数的生命,提供人类丰富的资源,其中包括各种海藻珍品。
据统计约有2万多种藻类,其中大部分含有一定的藻胶。
有的含褐藻胶(如褐藻类的海带),有的含琼胶(如红藻类的江蓠、伊谷草、沙菜、石花菜),有的含卡拉胶。
其中琼胶是经济价值较高的藻胶。
随着近代科技的发展,琼胶已被广泛应用到人类生活的各个方面。
例如,在医学和生物学上被用作培养基;在糖果和食品生产中被作为填充剂,在造纸工业中被用作粘合剂。
此外,在纺织、酿造、印刷和化妆品等工业中都被广泛应用。
琼胶制造业是水产加工工业的重要组成部分,用于提取琼胶的红藻主要有藻胶含量较高的红蓠、石花菜、伊谷草、沙菜等,它们是琼胶工业的主要资源。
随着琼胶工业的发展,有些国家进一步从琼胶中分离出琼胶素,并开始了工业生产。
琼胶又称琼脂、洋菜、冻粉,是从某些红藻(Rhodophyceae)中提取的亲水性胶体,外观为白色或类似白色的粉状或条状产品。
它不溶于冷水而溶于沸水,在1.5%时为澄清的液体。
冷却到34-43℃时形成较坚固的凝胶,再加热到85℃以下时不融化。
琼脂是有机化合物,其成分为碳水化合物,由D-蜂乳糖和3,6-脱水-蜂乳糖组成,存在于红藻细胞壁和髓部细胞间,是一种多醇的提取物。
琼胶制造工业的工艺流程如下:
原料预处理→煮胶提取→过滤→凝固→冻结→融解→干燥→成品→包装→质量标准检验→出厂。
成品琼胶外观为白色或淡黄色长条或粉末,根据国家标准GB-1975-80规定应符合表1中所列指标的要求。
有关琼胶的鉴别试验方法及质量标准测定方法可查阅有关相应的国家标准和资料。
琼酯糖(琼胶素)是琼胶经过分离除去硫琼胶部分而留下的硫酸基和灰分都很低的产品,是一种重要的生化试剂。
琼酯糖的性质和琼胶大致相同,比琼胶优越,它纯度高,灰分少,凝胶强度高,机械性能好,无色、透明度高,对一些蛋白质不吸附。
琼酯糖主要应用在细胞分离、基因重组等高级生物技术和在免疫学中的凝胶扩散诊断、预测各种疾病以及免疫电泳、对流电泳等技术方面。
琼酯糖在生物化学、医学方面的用途日益广泛,需求量日增。
目前我国南方主要是利用江蓠、紫菜等为原料提取琼胶,再利用琼胶提取琼酯糖。
本实验用EDTA2Na2法提取琼酯糖,并用蒽酮法测定所提取的琼酯糖中的碳水化合物含量。
表1食品级琼胶国家质量标准(GB1975-80)
指标名称
指标
干燥失重
灼烧残渣
吸水力
水不溶物
砷(As)
铅(Pb计)
淀粉
≤22%
≤5%
≥5倍自重
≤1%
≤0.0001%
≤0.004%
合乎规定
三、仪器设备、玻璃器皿和试剂
3.1仪器设备
(1)电热恒温水浴锅;
(2)冰浴锅;(3)SXL-1008型程控箱式电炉
(4)电热恒温干燥箱;(5)电子分析天平;(6)分光光度计。
3.2玻璃器皿和材料
(1)1L烧杯1个;
(2)200mL烧杯2个;(3)称量瓶1个;
(4)10mL具盖刻度试管8支;(5)500mL、50mL量筒各1个;
(6)1mL和5mL移液管各1支;(7)瓷坩埚1个;(8)干燥器1个;
(9)玻棒1根;(10)竹筷1双;(11)pH试纸;(12)纱绢袋1个;
(13)不锈钢盘20cm×30cm1个;(14)风干江篱;(15)市售琼脂。
3.3试剂
(1)次氯酸钠:
液体溶液。
(2)5%NaOH:
称5gNaOH固体,放入烧杯中,加入100mL蒸馏水溶解。
(3)10%HCl:
取10mL浓盐酸(12mol/L)用蒸馏水稀释至100mL。
(4)EDTA2Na2;
(5)蒽酮试剂(蒽酮、乙醇、硫酸):
称取0.2g蒽酮于100mL浓硫酸中,加入8mL乙醇和30mL超纯水。
该试剂可在冰箱中放置过夜,用前在室温下放置4h。
(6)葡萄糖。
四、实验内容
4.1琼胶提取和制备
4.1.1原料来源
工业上收购的红藻可分漂白和未经漂白两种。
漂白红藻的处理过程如下:
将江蓠或石花菜采收后摊开在沙滩上让阳光曝晒多天,每天泼3-4遍淡水,利用水在强烈日光照射下蒸发过程能产生具有漂白作用的H2O2进行漂白,并时常翻动红藻直至全部褪色。
褪色后,浸泡在淡水中,漂洗后摊晒,成为工业收购原料。
本实验也可采用H2O2直接处理,但成本较高。
4.1.2预处理
煮胶前的预处理方法很多。
不同的预处理方法对成品胶的颜色、凝胶强度、出胶难易和出胶率均有很大影响,因此,预处理方法是琼胶产品质量的一个重要环节。
实验中浸泡和加碱的目的是破坏细胞壁,使凝胶较易溶出,并有利藻体色素分解,使胶体变成无色透明,粘度变小易于过滤。
本实验学生分三组分别采取不同的处理方法:
(一)A组:
(1)取江蓠25g,用水洗至水清为止,用水浸泡1h后,置于1L烧杯中,加入100mL5%NaOH,置于沸水浴中煮50min;
(2)冷却后用约100mL10%HCl中和至pH=7;
(3)把水倒掉后用约50mL次氯酸钠漂白;
(4)用大量水冲洗至中性。
(二)B组:
(1)取江蓠25g,用水洗至水清后置于1L烧杯中,加入100mL5%NaOH,置于沸水浴中煮50min;
(2)冷却后用约100mL10%HCl中和至pH=7;
(3)把水倒掉后用约25mL次氯酸钠漂白;
(4)用大量水冲洗至中性。
(三)C组:
(1)取江蓠25g,用水浸泡1h,水洗至清为止,置于1L烧杯中,用约25mL次氯酸钠漂白江篱;
(2)用水漂清干净(pH=7)后,加入100mL5%NaOH,于沸水浴中煮50min;
(3)冷却后用约100mL10%HCl中和至pH=7;
(4)用大量水冲洗至中性。
4.1.3煮胶、提取和过滤
将上述处理过的红藻,加水100mL,置于在水浴锅中煮胶提取1h后,趁热倒入80~100目的粗尼龙袋中,进行过滤,滤液盛于不锈钢盘中。
袋内藻渣压滤后,可加入干藻重5~10倍的水,再煮沸0.5h,滤液可做下次提取琼胶的用水或直接做成低级品琼胶。
不锈钢盘内的琼胶滤液,置于室温下自然冷却凝固。
完全凝固后,用刀将胶块切成条状。
4.1.4冻结和干燥
为纯化胶质,去除杂质,可采用冻结(琼胶中水分结成冰)、融化(水分和琼胶中的无机盐及可溶性杂质一同从胶体中流出而分离)步骤,反复多次,就可使胶条完全干燥。
本实验可在电冰箱里模拟生产工艺进行实验,直至完全干燥后,称重。
4.1.5产胶率计算
注意记录外观颜色,比较不同预处理方法的产胶率%。
计算公式如下:
产胶率=制得胶重量(g)/样品重量(g)×100
4.2琼胶含水率、灰分和吸水力测定
4.2.1水分测定
取洁净玻璃称量瓶,置于105℃干燥箱中,瓶盖斜盖于瓶边,干燥40min,取出盖好,冷却至40~50℃,置于干燥器中30min,称至恒重(W1)。
称取约1g琼胶(W2)于称量瓶中,置于烘箱在105±1℃干燥2h,冷却至40~50℃,放干燥器30min后称至恒重(W3)。
计算公式如下:
X=(W3–W1)/W2×100
式中:
X—样品含水率(%);W1—称量瓶的重量(g);W2—称量瓶和样品的重量(g);W3—称量和样品干燥后的重量(g)。
4.2.2灰分测定
取大小适宜的瓷坩埚置于箱式电阻炉中,在450℃下灼烧0.5h,冷却至200℃以下后取出,放入干燥器中冷却至室温,称重,并重复灼烧至恒重,称量(W1)。
准确称取约1g琼胶样品(W2)。
置于瓷坩埚内在箱式电阻炉中于600℃灼烧至无炭粒(2h),即灰化完全。
冷却至200℃以下后取出放入干燥器中,冷却至室温,称量。
重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒重,称量(W3)。
灰分%计算公式如下:
Y=(W3–W1)/W2×100
4.2.3吸水力测定
称取1g琼胶样品(W1),置于200mL的烧杯中,加入160mL水在35℃浸泡2h,待充分溶胀后(如果不溶胀可提高水温至50~60℃),用纱绢布滤去水分,称重W2,计算吸水力Z%。
计算公式如下:
Z=(W2–W1)/W1×100
4.3琼酯糖提取
4.3.1琼酯糖提取
称取0.25gEDTA2Na2置于100mL烧杯中,加入40mL蒸馏水,搅拌使之溶解,再加入2.27g琼胶,在60℃下恒温4h,并不断搅拌,这时EDTA使琼胶变成水溶性而琼酯糖不溶,用纱绢布过滤,用水充分洗涤,浸泡过夜,自然干燥即得琼酯糖。
4.3.2琼酯糖含水率和产率计算
本实验由于后续实验要测定琼酯糖的碳水化合物,故用水充分洗涤后,用纱绢布滤去水分,称重(W1),称取1g用于碳水化合物的测定,余下的自然风干后称重(W2),其含水率%和琼酯糖的产率%的计算如下:
琼酯糖含水率=(W1-W2)/W1×100
琼酯糖产率=[W2+1×(1-琼酯糖含水率/100)]/2.27×100
4.4蒽酮法测定琼酯糖的碳水化合物(CHO)含量
4.4.1蒽酮试剂配制
称取0.2g蒽酮于100mL浓硫酸中,加入8mL乙醇和30mL超纯水。
该试剂可在冰箱中放置过夜,使用前取出在室温下放置4h。
4.4.2工作曲线绘制
(1)取6支比色管,分别加入0.0,0.1,0.2,0.3,0.5,1.0mL浓度为100μg/mL的葡萄糖使用液,再对应地加入超纯水至1mL,使其浓度分别为0,10,20,30,50,100μg/mL。
(2)将比色管置于冰浴中,加入5.0mL的蒽酮试剂,振荡混匀后,将比色管置于100℃水浴箱中,恒温10min。
(3)取出比色管,在自来水中放置10min后,用722型分光光度计在波长620nm处,用1cm的比色皿测其吸光值A,以超纯水为参比。
(4)空白校正:
每批样品测定时均需测定空白值A0。
若A0超过0.1,应重新配制蒽酮试剂。
同时也用超纯水校正每个比色皿,以消除比色皿误差。
(5)以吸光值A-A0对浓度作图,绘制工作曲线。
4.4.3样品测定
(1)样品制备:
将上述实验制备的含水琼酯糖1g,加入200mL蒸馏水,在100℃的水浴中加热至完全溶解呈透明液体备用。
(2)样品测定:
移取1mL上述制备的样品溶液于10mL比色管中,按照工作曲线绘制的测定步骤测其吸光值。
若如果浓度太高,则需稀释样品溶液后重新测定。
4.4.4琼酯糖CHO含量计算
由工作曲线求样品溶液的CHO浓度(μg/mL)。
所制备琼酯糖的CHO的重量百分含量计算公式如下:
碳水化合物重量百分含量(%)=样品溶液CHO总含量/琼酯糖重量(g)×100
五、实验要求
1.计算所提取琼胶样品的产胶率,并对照用不同预处理方法(A组、B组和C组)提取的琼胶的产率、外观颜色等特征有何不同?
讨论原因。
2.计算实验提供的成品琼胶的水分、灰分和吸收率。
3.计算所提取的琼酯糖的含水率和产率。
4.计算所制备琼酯糖的碳水化合物重量百分比。
参考文献:
[1]中华人民共和国国家标准(GB5009.3-1985),食品中灰分测定方法
[2]陈申如等.不同来源琼胶提取琼酯糖比较,海洋水产研究,2002,23(4):
51-55
实验十简易快速水质分析箱的研制及应用
一、目的要求
1.通过已学过的基础知识,自行设计和制作简易快速的水质分析箱;
2.应用所研制的分析箱现场监测水样,并与实验室标准方法的结果相对照。
二、实验项目的意义
目前,我国水产品养殖产量已超过海洋捕捞量。
随着现代水产养殖技术的发展,尤其是“名、贵、特、优”精养品种的开发,人们对水质的要求越来越严格。
水质的好坏,与水产养殖生产的丰歉休戚相关。
能否及时准确地监测其主要水质指标的浓度及变化趋势至关重要。
目前国内水质测定大部分采用现场取样,在实验室进行化学分析。
由于某些物质稳定性差,从取样到分析过程中,可能已造成浓度的变化,分析结果不一定能反映现场水质情况;另一方面,它需要有一定专业知识的技术人员来进行测试。
因此,研制一种使用方便,随身携带,一般养殖人员可自行操作使用的水质监测方法,对了解水质情况,及时指导养殖业生产是很有必要的。
三、实验实施步骤
本实验试图通过已学过的基础知识,让学生自行设计和制作简易快速的水质分析箱(主要测定指标有:
pH、DO、氨氮)现场监测应用并和实验室标准方法对照检验。
实验分为三阶段:
第一阶段教师课堂讲授,提示水样箱制作原理,学生根据有关参考资料(附录一)自行设计方案,第二阶段学生提交设计方案,教师课堂讲授实验原理、步骤,并发给实验讲义(附录二);第三阶段,学生完成全部研制及现场应用,(二人制作一个水样盒,六人组成一个水样箱),并写出实验报告。
四、实验要求
4.1设计实验方案
要求写出pH、DO、氨氮水样盒的原理、试剂与仪器、实验步骤;
4.2撰写实验报告
(1)写出水样箱简单使用说明书及内部构造示意图;
(2)按附录二的实验要求,填写水样pH、DO、NH4+-N的测定结果;(3)比较标准法与目视比色法的相对偏差;(4)比较水样充氧前后各项指标的变化情况;(5)根据水质标准(表1)评价水样的级别。
表1养殖水水质标准
水质标准
1
2
3
4
5
pH
6.5~8.5
6.5~8.5
6.5~8.5
6.5~8.5
6.5~9
DO(mg/L)
7
6
5
3
2
NH3-N(mg/L)
0.2
0.4
0.5
0.7
1.0
附录一实验十实验方案设计参考资料
一、缓冲溶液的配制
1.1通用缓冲溶液
基本溶液:
⑴、0.200M氯化钾溶液(14.912gKCl/L)
⑵、0.200M盐酸溶液(12mol/L)
⑶、0.200M邻苯二甲酸氢钾溶液(40.835gKHC8H4O4/L)
⑷、0.200M邻酸二氢钾溶液(27.218gKH2PO4/L)
⑸、0.200M柠檬酸二氢钾溶液(46.032gKH2C6H5O7/L)
⑹、0.400M氢氧化钠溶液
⑺、0.200M氢氧化钠溶液
⑻、0.100M氢氧化钠溶液
⑼、0.200M硼酸0.200M氯化钾溶液(12.40gH3BO3+14.912gKCl/L)
⑽、0.200N乙酸溶液
⑾、0.400N乙酸溶液
配制方法:
按下表将指定的两种基本溶液混合后稀释至200毫升
pH
基本溶液(mL)
pH
基本溶液(mL)
(1)液
(2)液
(4)液
(7)液
1.0
50
97.0
5.8
50
3.72
1.2
50
64.5
6.0
50
5.70
1.4
50
41.5
6.2
50
8.60
1.6
50
26.3
6.4
50
12.60
1.8
50
16.6
6.6
50
17.80
2.0
50
10.6
6.8
50
23.65
2.2
50
6.7
7.0
50
29.63
(3)液
(2)液
7.2
50
35.00
2.2
50
46.7
7.4
50
39.50
2.4
50
39.60
7.6
50
42.80
2.6
50
32.95
7.8
50
45.20
2.8
50
26.42
8.0
50
46.80
3.0
50
20.32
(5)液
(2)液
3.2
50
14.70
2.2
50
99.4
3.4
50
9.90
2.4
50
86.8
3.6
50
5.97
2.6
50
73.6
3.8
50
2.63
2.8
50
60.4
(3)液
(7)液
3.0
50
47.2
4.4
50
0.40
3.2
50
34.4
4.2
50
3.70
3.4
50
21.4
4.4
50
7.50
3.6
50
8.4
4.6
50
12.15
(4)液
(8)液
4.8
50
17.70
3.8
50
4.0
5.0
50
23.65
4.0
50
18.0
5.2
50
29.95
4.2
50
32.6
5.4
50
35.54
4.4
50
57.4
5.6
50
39.85
4.6
50
63.0
5.8
50
43.00
4.8
50
78.4
6.0
50
45.45
5.0
50
93.4
6.2
50
47.00
5.2
50
108.4
(6)液
(10)液
5.4
50
122.0
3.8
50
84.30
5.6
50
136.0
3.9
50
69.02
5.8
50
148.0
4.0
50
56.88
(9)液
(7)液
4.1
50
47.24
7.8
50
2.61
4.2
50
39.58
8.0
50
3.97
4.3
50
33.48
8.2
50
5.90
4.4
50
28.66
8.4
50
8.50
4.5
50
24.82
8.6
50
12.00
4.6
50
21.78
8.8
50
16.30
4.7
50
20.00
9.0
50
21.30
4.8
50
19.36
9.2
50
26.70
4.9
50
17.44
9.4
50
32.00
5.0
50
15.90
9.6
50
36.85
(6)液
(11)液
9.8
50
40.80
4.8
50
87.2
10.0
50
43.90
4.9
50
79.5
5.0
50
73.4
5.1
50
68.6
5.2
50
64.8
5.3
50
61.7
5.4
50
59.3
5.5
50
57.4
5.6
50
55.9
5.7
50
54.7
1.2磷酸缓冲液
配制方法:
xmL1/15mol/L磷酸氢二钠+ymL1/15mol/L磷酸二氢钾
pH
x
y
pH
x
y
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
3.0
5.0
7.8
12.0
18.5
26.5
37.5
97.0
95.0
92.2
88.0
81.5
73.5
62.5
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
50.0
61.1
71.5
80.4
86.8
91.4
94.5
50.0
38.9
28.5
19.6
13.2
8.6
5.5
1/15mol/L磷酸氢二钠溶液含Na2HPO4ּ2H2O11.876g/L或Na2HPO49.4g/L;
1/15mol/L磷酸二氢钾溶液含KH2PO49.078g/L。
1.3硼酸缓冲液(0.2mol/L)
配制方法:
xmL0.2mol/L硼酸+ymL0.05mol/L硼砂
pH
x
y
pH
x
y
7.4
7.6
7.8
8.0
9.0
8.5
8.0
7.0
1.0
1.5
2.0
3.0
8.2
8.4
8.7
9.0
6.5
5.5
4.0
2.0
3.5
4.5
6.0
8.0
0.2mol/L硼酸含H3BO412.37g/L;0.05mol/L硼砂含Na2B4O7ּ10H2O19.07g/L。
1.4Tri-HCl缓冲液
配制方法:
xmL0.2mol/Ltri-液+ymL0.1mol/LHCl加水稀释至100mL
pH
x
y
pH
x
y
23˚C
27˚C
23˚C
27˚C
7.20
7.36
7.54
7.66
7.77
7.87
7.96
8.05
8.14
7.05
7.22
7.40
7.52
7.63
7.73
7.82
7.90
8.00
25
25
25
25
25
25
25
25
25
45.0
42.0
40.0
37.0
35.0
32.5
30.0
27.5
25.0
8.23
8.32
8.40
8.50
8.62
8.74
8.92
9.10
8.10
8.18
8.27
8.37
8.48
8.60
8.78
8.95
25
25
25
25
25
25
25
25
22.5
20.0
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
0.2mol/Ltri-液含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L。
二、常用酸碱指示剂的配制
2.1单一指示剂
名称
颜色变化
有效pH
变色范围
配制方法
酸
碱
甲酚红
(酸范围)
红
黄
0.2~1.8
100mg指示剂与2.6mL0.1NNaOH研匀,用水稀释至250mL;或100mg溶于100mL20%酒精中.
百里酚蓝
(酸范围)
红
黄
1.2~2.8
100mg指示剂与2.15mL0.1NNaOH研匀,用水稀释至250mL;或100mg溶于100mL20%酒精中.
甲基黄
红
黄
2.9~4.0
100mg溶于100mL90%乙醇.
溴酚蓝
黄
紫
2.8~4.6
100mg指示剂与3mL0.1NNaOH研匀后用水稀释至250mL;或100mg溶于100mL20%酒精中.
甲基橙
红
橙黄
3.1~4.4
100mL指示剂钠盐溶于100mL水中.
溴甲酚绿
黄
蓝
3.6~5.2
100mg指示剂与3mL0.1NNaOH研匀后用水稀释至250mL;或100mg溶于100mL20%酒精中.
刚果红
红紫
红橙
3.0~5.0
100mg溶于250mL水或80%酒精中.
甲基红
红
黄
4.2~6.3
钠盐:
0.1g溶于250mL水中.
游离酸:
200mL指示剂溶于100mL60%乙醇.
氯酚红
黄
紫红
4.8~6.4
0.1克溶于250mL含2.36mL0.1NNaOH的水中.
溴甲酚紫
黄
红紫
5.2~6.8
0.1克溶于250mL含1.85mL0.1NNaOH的水或20%乙醇。
石蕊
红
蓝
5.0~8.0
0.5—1克指示剂溶于100mL水中.
溴百里酚蓝
黄
蓝
6.0~7.6
0.1克溶于250mL含1.6mL0.1NNaOH的水或20%乙醇。
酚红
黄
红
6.8~8.4
0.1
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