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1.3EGF的生物学效应及应用
细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。
自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式,在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。
EGF生物效应很多,如下所述:
1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要,从基因上赋予它很高分裂效率。
EGF在其中起着关键性的作用。
首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象,证明有大量的细胞死亡。
同样,皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂,新的皮肤又长出来了。
EGF在创伤修复中起着功不可没的作用,在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究[12]取得重大的突破,在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合,使病人的痛苦少一点。
2.眼睛是我们重要的部分,眼睛的部分受到伤害特别是眼角膜,是我们最担心的。
在现实生活中,很多病人由于眼角膜的伤害再加上眼角膜的捐献者少之又少无法得到修复。
实验研究结果表明,适宜浓度的hEGF滴眼液,能通过刺激角膜上皮细胞及基质成纤维细胞的增生与迁移和促进细胞外基质与胶原纤维增生,使损伤修复速度加快,从而辅助修复角膜[13]。
3.研究表明,多数肿瘤的发生、发展,与EGF之间存在一定的关系。
细胞中存在原癌基因和抑癌基因,癌变可能由于这些基因的突变细胞,使细胞生长不受控制。
肿瘤细胞表面的EGF受体属于多聚体受体,多个EGF的表达之后与受体结合,使细胞不停的生长,这样,与胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的恶性程度增加[14]。
4.是药三分毒,我们吃的要中有些药对人的胃刺激很大。
实验表明:
在人的胃溃疡中受损伤的细胞与保护药硫酸铝相结合,可以使溃疡有较高浓度的内源性EGF表达,从而促进溃疡愈合[15]。
1.4本实验课程设计的目的与内容
1.实验课程设计目的:
本实验课程设计重在学生自己动手设计实验,老师起辅助指导作用,旨在训练学生对专业综合知识的运用。
学生需查阅文献和数据库来设计与理解设计方案,主要考察学生对基因分子克隆、表达、发酵和蛋白分离知识的理解与应用,以培养学生的专业综合知识应用与实验动手操作能力。
2.实验课程设计内容:
以表皮生长因子(EGF)为例,让学生从基因的设计入手,合成出完整的EGF基因,然后表达并纯化出该EGF蛋白。
主要内容简述如下:
(1)通过NCBI数据库网站设计出完整的EGF基因,并设计出引物;
(2)pET-28a衍生质粒为载体、将EGF基因转化如大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中,并通过双酶切和PCR挑选验证转化子;
(3)诱导重组大肠杆菌表达hEGF蛋白;
(4)经超声破碎提取、SDS-PAGE电泳检测
(5)采用镍柱纯化,进而获取hEGF蛋白纯品。
第二节EGF基因的合成与转化表达
1.实验原理
人源表皮生长因子(hEGF)来源大致有三个方向:
一是来源于人体代谢物的提取;
二是来源于化学合成;
三是来源于基因工程生产技术,这也是近些年来可以大量生产获得hEGF的方法。
前两种方式得到的产品都只有很低的纯度,并不能在实际应用中发挥很大的价值。
。
目前已知的研究中,hEGF基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母以及动植物等宿主系统中已经成功克隆表达。
以pET等衍生质粒为载体、以BL21(DE3)为表达宿主菌的表达系统是发展较成熟的大肠杆菌表达系统之一,它采用T7强启动子,在IPTG诱导下,启动外源基因的高转录。
pET载体有pET32a(±
)和pET28a(±
)等系列。
下图1为PET28a质粒载体的物理图谱。
图1PET28a质粒载体
2.实验材料与方法
2.1实验材料及仪器
2.1.1试剂材料及试剂
琼脂粉、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、1mol/LNaOH溶液、双蒸水、10mg/mlKana母液、PET-28a菌种、E.coliDE3菌种、酒精、含质粒载体的PET-28a菌液、小型质粒快速提取试剂盒(离心柱型)、Goldview、BIOWESTAGAROSE、loadingbuffer(6×
)、HindⅢDNAMarker、TAE电泳缓冲液(1×
)、0.1mol/LCaCl2溶液、ZdeI酶(10U/μl)及其10×
Buffer、Xhol酶(10U/μl)及其BufferD10×
、GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5U/µ
lTaqDNA聚合酶、PCR缓冲液(10×
,含Mgcl2)、dNTP混合物、上游引物、下游引物、无菌双蒸水、1mol/l的异丙基硫代半乳糖苷(TPTG)、PBS(1×
)、SDS-PAGE蛋白凝胶配制试剂盒:
30%Acr-Bis(29:
1)、1.5MTris-Hcl,pH8.8、10%SDS、10%过硫酸铵(AP)溶液、TEMED、1MTris-Hcl,pH6.8;
2×
上样缓冲液、1×
Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液Ⅰ(45%甲醇:
10%乙酸:
45%蒸馏水)、脱色液Ⅱ(5%甲醇:
7%乙酸:
88%蒸馏水),双蒸水
2.1.2仪器设备
试管、量筒、天平、药匙、称量纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温生化培养箱、涂棒、接种环、酒精灯、pH试纸、记号笔、麻绳、棉花、报纸、镊子、滴管、10ml移液管、恒温摇床、Eppendorf管、微量移液器、枪头、高速离心机、电泳仪、电泳槽、水平凝胶电泳槽和梳子以及其制胶模块、250ml锥形瓶、微波炉、凝胶成像系统、分光光度计、制冰机、冰盒、恒温水浴锅、超净工作台、水漂、0.2mlPCR微量管、双面微量离心管架、PCR仪、紫外检测仪、脱色摇床、台式冷冻离心机、垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子、1.5ml微量离心管、搪瓷盘
2.2实验方法
2.2.1试剂及培养基配制方法
1.卡那霉素母液(10mg/mL)的配制:
称取10mg卡那霉素溶解于1ml无菌水中,然后采用无菌过滤器过滤后分装于Eppendorf小管中。
2.培养基的配制
(1)LB培养基:
配方(固体培养基加琼脂粉)
1000ml150ml
蛋白胨
酵母浸粉
NaCl
琼脂粉
去离子水
10g1.5g
5g0.75g
18g2.7g
950mL142.5mL
(2)含卡那霉素(Kana)LB固体培养基:
将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Kana储存液,使终浓度为50µ
g/ml,摇匀后铺板。
(3)含Kana的LB液体培养基:
每15mLLB液体培养基分装至试管中,高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Kana母液,使终浓度为50µ
g/ml)
2.2.2目的基因hEGF的设计与合成
hEGF的cDNA序列自NCBI上查阅文献得到其编号(NM_001963.2)[21],在NCBI的数据库中查获其序列为:
根据其序列和限制性酶切位点XhoI和NdeI引入其上下游引物分别为:
F:
5’-AGTGACTCTCAATGTCCC-3’;
R:
5’-TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3’。
委托上海捷瑞生物工程有限责任公司合成目的基因hEGF序列,并将其插入到质粒载体PET28a的限制性酶切位点XhoI和NdeI之间。
公司将含有目的基因序列的重组质粒PET28a-hEGF保存在穿刺菌细胞XL10中寄回。
2.2.3提取重组质粒
(1)在灭菌后的无菌操作台中,取15ml分装至试管中的、灭菌后的LB液体培养基,加入卡那霉素母液150µ
L,保证它在培养基中为50µ
g/mL。
(2)将含目的基因的重组质粒的穿刺菌XL10接种无菌LB培养基(含50µ
l/mL卡那霉素),37.C摇床过夜培养(不能超过15h)。
(3)取收取的2ml的菌液于2mlEp管中,用于提取质粒。
(4)提取质粒,按质粒小量制备试剂盒操作说明书操作。
2.2.4电泳检测质粒DNA
(1)称取0.3g琼脂粉BIOWESTAGAROSE,放入三角瓶中,加入30mlTAE电泳缓冲液(1×
),制成1%的胶,在微波炉中烧开。
(2)待彻底熔化后,停止加热。
(3)取出三角瓶,自然冷却至不烫手,加入1.7µ
lGoldview染液。
(4)插入梳子后缓缓倒入胶液,至模具的矮边缘即可,平放等待彻底凝固。
(5)在电泳槽里加满1×
TAE缓冲液,调电压至140V(10V/cm)。
(6)胶全凝固后,小心拔出梳子,放入电泳槽中,凝胶要没入缓冲液中。
(7)在塑料片上,点5µ
l(6×
)loadingbuffer,再加入1µ
l上述质粒DNA提取产物,混合均匀。
(8)在凝胶上选择相邻的加样孔,用吸液头分别将管中的样品和DNAMarker加入凝胶的加样孔中。
(9)打开电源,样品以蓝色的横带泳动,电泳约30min。
(10)当蓝色泳动到凝胶边缘1cm时,关掉电源。
取出模具和凝胶放入成像系统中,观察结果图,并保存。
2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)宿主菌的培养
挑取新活化的E.coliBL21(DE3)单菌落,接种于4mlLB液体培养基中,37℃下恒温发酵培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液1ml接种于100mlLB液体培养基中,37℃摇床培养3~4小时至OD590=0.4~0.5左右。
(2)制备感受态细胞(CaCl2法)
I、将发酵后的菌液转入2mL预冷、无菌的离心管中,冰置10分钟,4℃5000rmp离心10分钟。
Ⅱ、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2
溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰置30分钟后,4℃,5000rmp,10分钟离心。
Ⅲ、弃去上清,加入1ml预冷0.1mol/L的CaCl2
溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟。
Ⅳ、在离心机中4℃下5000rmp离心10分钟,保留沉淀,200μL预冷的0.1mol/L的CaCl2
溶液重新悬浮,无菌操作台中将其分装成100μL的小份,在冰上放置2小时以上,便可直接用作宿主菌的转化实验。
2.2.6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3)
I、在超净工作台上,取上述感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌液,加入PET28a质粒DNA溶液5μl,轻轻摇匀,置于冰上放30分钟.
Ⅱ、在42℃水浴锅中热击90s,迅速在冰上冷却5分钟。
Ⅲ、往试管中加入1mlLB液体培养基(不含kan),37℃摇床发酵1小时。
Ⅳ、将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Kan的固体LB平板上,正面朝上上放置半小时到一个小时待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃条件恒温培养箱中培养16-24小时。
设置对照:
以相同体积的无菌双蒸水代替质粒样品溶液,其它操作与上述相同。
此对照正常情况下应无菌落出现。
2.2.7检测转化是否成功
提取转化后大肠杆菌的质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测:
参见前面质粒提取以及琼脂糖凝胶电泳检测的方法。
将两次提取的质粒在同一块凝胶中电泳,对比其电泳条带。
2.2.8双酶切并检测
(1)先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。
从-20℃冰柜中取出限制性内切酶,立即插入冰块中。
(2)用20µ
l的反应体系进行双酶切:
无菌双蒸水14µ
l、10×
HBuffer2µ
l、BSA1µ
l质粒1µ
l混匀,限制性内切酶XhoI、NdeI各1µ
l。
(3)混匀离心管使管中的溶液。
在离心机中5000rpm离心30秒。
取出后插到水漂的孔中,37.C水浴酶切2h。
(4)酶切后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(方法参照上述),制1.5%的琼脂糖凝胶,电泳以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
2.2.9EGF基因的PCR扩增验证
取无菌的0.2mlPCR管,置于冰中,在其中添加如下成分如表3:
表3PCR反应体系
无菌水
17µ
l
10×
PCR缓冲液(含Mgcl2)
2.5µ
dNTP混合物
2µ
上游引物
1µ
下游引物
待扩增DNA模板
TaqDNA聚合酶(5U/µ
l)
0.5µ
终体积
25µ
混匀后,稍作离心(如果利用非热盖型PCR仪器,应添加30µ
l石蜡油于反应管中,防止样品水分的蒸发)[17]。
将反应管放入PCR仪,按下列条件设定反应程序,进行PCR反应,如表4:
表4PCR反应过程
94℃预变性5min
变性94℃30s
退火55℃30s循环25次
延伸72℃30s
最后在72℃保温10min
PCR反应结束后,取5-10µ
l反应液做电泳检测,鉴定PCR反应产物是否存在,及其大小。
电泳确认后,PCR产物即可用于下一步操作或冰箱保存。
2.2.10目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE检测
2.2.10.1目的基因的诱导表达
重组菌的扩增:
接种转化了pET-28a-hEGF的EcoliDE3于含Kana(50µ
g/mL)的LB液体培养基中,37℃,200rpm,振荡培养过夜。
转接100µ
L过夜培养物,于100mL的LB液体培养基,于37℃,200rpm,振荡培养至OD600值在0.7-1.0。
从中取出1.0ml菌液,离心,弃去上清,40µ
LPBS悬浮,备用于后面SDS-PAGE电泳操作。
重组菌外源基因的诱导表达:
向扩大培养的培养基中加入1000µ
L0.1mol/LIPTG(至终浓度1mmol/L),于37℃振荡培养3-4h。
蛋白样品的抽提:
将诱导后菌液,4.0℃,5000rpm/min,离心10min,弃去上清。
将所得的菌体沉淀,用PBS溶液悬浮,并转移到10ml离心管中,向管中继续加入PBS至适宜采用超声破碎仪破碎为止,大约5ml。
用移液器吹打,充分悬浮细胞后,将离心管放到盛有的冰块的烧杯中。
清洗并擦拭超声破碎仪的金属杆,然后将超声破碎仪的金属杆插入到离心管中,调整好位置,关上超声破碎仪的门,打开电源,设置程序,开始对细菌经行超声破碎[17]。
破碎设置:
功率400W左右;
工作2s;
间隔8s;
破碎时间10min。
破碎处理后的细菌细胞,10000rpm/min离心10min。
取出离心管,吸取上清液至新的离心管中,此即为所抽提的蛋白样品,可用于后续操作[17]。
把离心的沉淀用40µ
LPBS悬浮,亦备用于后续SDS-PAGE电泳操作。
2.2.10.2SDS-PAGE电泳检测
1.分别将未诱导前的菌体悬液、诱导破碎后的菌体上清和诱导破碎后的沉淀悬浮液分别和一部分过柱纯化洗脱好的蛋白与5×
上样缓冲液按4:
1混匀于微量离心管中。
2.将上述四个微量离心管插入水漂,沸水中煮5min。
然后立即插入冰中。
样品冷却到室温,5000rmp离心5min。
3.按要求组装电泳装置,并验漏。
4.配制分离胶及浓缩胶:
根据目的蛋白的分子量大小,选择合适的凝胶浓度。
不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围,如表5:
(1)SDS-PAGE分离胶,如表6:
配制12%分离胶,按顺序和量(注意体积单位!
)取下列溶液,在50ml的小烧杯中混合(注意Tris为pH8.8)。
蛋白质分子量范围(KD)
适宜的凝胶浓度(%)
﹥100
8
30-100
10
10-30
12
﹤10
15
表5SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围
体系组成
体积
双蒸水
3.3
1)(ml)
4.0
1.5MTris-Hcl,pH8.8(ml)
2.5
10%SDS(ml)
0.1
10%过硫酸铵(AP)溶液(ml)
TEMED(µ
L)
4
总体积(µ
表6SDS-PAGE分离胶反应体系
2
0.5
1.0MTris-Hcl,pH6.8(ml)
10%SDS(µ
40
10%过硫酸铵(AP)溶液(µ
30
3
表7SDS-PAGE浓缩胶体系
加完试剂后,拿起烧杯轻轻晃动底部,将溶液混匀后,立即用1000µ
L移液器,缓缓把胶液注入玻璃夹缝,每次余部分胶液于枪头内,以免产生气泡。
然后在上界面用200µ
L移液器轻轻地沿玻璃壁均匀地加蒸馏水,从左到右,以免造成胶面不平整,两液面的交界处呈波浪形,然后静置30min。
倒出蒸馏水,并倒置玻璃装置,尽可能把水倒尽,然后用滤纸吸去残留的水。
(2)SDS-PAGE浓缩胶:
见表7。
配制5%分离胶,按顺序和量(注意体积单位!
)取下列溶液,在一个50ml的小烧杯中混匀(注意Tris为pH6.8)。
加完后,拿起烧杯轻轻晃动,将溶液混匀后,立刻用1000µ
L移液器缓缓注入玻璃夹缝中,液面与玻璃上边缘齐平。
然后再慢慢插入梳子,静置约20min。
5.小心地垂直拔出梳子,用蒸馏水冲洗加样孔2次,然后用滤纸吸干。
电泳槽的上部倒满电泳缓冲液(约250ml,淹没过加样槽的液面),电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液(约180ml)
【19】。
6.选取形态好的加样孔,在一张空白纸上做好对应的标记,用微量移液器在靠边缘的一个加样槽中加入5µ
L蛋白Marker,其它槽中加入30µ
L自己制作的样品。
7.接好电极,将电压调至80V,待溴酚蓝移到分离胶后,再调电压至120V,电泳约2h。
期间注意观察电泳槽上部的电泳液是否有泄漏(泄漏导致液面下降,电流中断)。
当溴酚蓝移到距底部≤0.5cm时,切断电源。
8.在一个大的培养皿里,准备适量的考马斯亮蓝染液。
9.倒掉电泳槽中的电泳液,取下玻璃板,用刀片轻轻撬开,用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处,将分离胶切下,并在分离胶的左上角切掉一小角,以标记样品顺序【19】。
然后用水稍微冲一下玻璃板,戴手套用梳子小心地把分离胶从玻璃板上剥离到培养皿中,盖上盖,在脱色摇床上染色45min。
10.染色后,将染液回收,以备重复使用。
在培养皿中加脱色液Ⅰ,摇床上脱色45min。
倒掉脱色液Ⅰ,更换为脱色液Ⅱ,摇床上脱色45min。
更换新的脱色液Ⅱ,脱色摇床上脱色过夜,至大部分蓝色褪尽。
11.观察脱色后电泳胶中的蓝色带纹。
对照、寻找异常粗的带纹,并比较其分子量,判断是否为预期目的基因的产物。
第三节EGF表达蛋白的纯化与检测
--------镍离子金属螯合亲和层析
3.1实验原理
金属螯合亲和层析(ImmobilizedMetal-ionAffinityChromatography),其纯化原理是:
组氨酸(His)的侧链带有1个咪唑基团,咪唑基团pKa值在6左右,在pH>7的条件下,咪唑基团带负电,容易与Ni2+离子结合,尤其是带有6个组氨酸(6xHis)标签的重组蛋白对Ni2+离子具有极好的亲和力。
通过介质固定Ni离子能够选择性地纯化含有多个组氨酸的蛋白以及多肽;
吸附在Ni2+离子上的蛋白可以使用咪唑进行竞争洗脱分离。
常用于Ni2+离子金属螯合亲和层析的介质为NTA(Nitilotriaceticacid)。
镍离子有六个螯合价位,NTA螯合了四价,剩余两价与蛋白质上的组氨酸结合(如下图所示)。
3.2可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法
3.2.1缓冲液配制(使用0.45μm滤器过滤)
1.缓冲液A(平衡缓冲液):
1L
20mMNa2HPO4.2H2O3.56g
500mMNaCl29.2g
20mMImidazole2.04g
用HCl(6M)调节pH至7.4,定容至1L。
2.缓冲液B(洗脱缓冲液):
0.5L
20mMNa2HPO4.2H2O1.78g
500mMNaCl14.6g
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