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化学系新模版
邯郸学院本科毕业论文
题目三黄片HPLC指纹图谱的研究
学生杜翼
指导教师刘妍副教授
年级2006级
专业化学
系部化学系
邯郸学院化学系
2010年5月
郑重声明
本人的毕业论文是在指导教师刘妍老师的指导下独立撰写完成的。
如有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权的行为,本人愿意承担由此产生的各种后果,直至法律责任,并愿意通过网络接受公众的监督。
特此郑重声明。
毕业论文作者:
年月日
摘要本论文初步建立了三黄片的HPLC指纹图谱,为三黄片生产过程质量控制的依据和方法提供了参考。
采用甲醇-磷酸(100:
1)为溶剂,35℃超声提取45min后微膜过滤,获得供试品溶液。
选取如下色谱条件:
色谱柱为VPODSC18(4.6mm×150mm,5µm),柱温为30℃,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,以甲醇和0.2%的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。
结果显示10批三黄片有19个共有峰,根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析,得出其相似度>98%。
该方法简便可靠,可用于建立三黄片的指纹图谱,也可用于三黄片生产过程中的质量控制和对产品的质量评价。
关键词三黄片高效液相色谱指纹图谱
DeterminationoftheFingerprintChromatogramofSanHuangtabletbyHPLC
DuYiDirectedbyViceProf.LiuYan
AbstractAneffectiveandconvenientmethodwasestablishedforHPLCfingerprintsofSanHuangtabletwhichprovidedanapproachforqualitycontrolinproduction.Thechromatographicconditionsareasfollows:
thecolumnfortheVPODSC18(4.6mm×150mm,5µm),thetemperaturefor30℃,aflowrateof1.0ml/min,detectionat280nm,withacetonitrileand0.2%phosphateacidaqueoussolutionformobilephasegradientelution.Theresultsshowedthat19peakswereindicatedontheHPLCfingerprintofSanHuangtablet.Accordingtothecomputersoftware-assistedanalysisofsimilarity,thesimilarityof10batchesofSanHuangtabletwasnotlowerthan0.98.Themethod,whichissimpleandreliable,canbeusedtoestablishSanHuangtabletfingerprintandalsobeeffectivelyusedforqualityevaluationandqualitycontrolinSanHuangtablet’sproduction.
KeywordsSanHuangtabletHPLCFingerprints
目录
摘要I
外文页II
1序言1
2实验部分2
2.1仪器和药品2
2.1.1实验仪器2
2.1.2实验试剂2
2.1.3实验用药品2
2.1.4标准品3
2.2三黄片HPLC指纹图谱色谱的建立3
2.2.1供试品的制备3
2.2.2色谱条件3
2.2.3方法学考察及相似度计算3
2.3批次药品的指纹图谱测定4
2.4特征峰的指认6
3讨论7
3.1色谱条件的选择7
3.1.1供试品制备条件的选择7
3.1.2流动相的选择7
3.1.3梯度的调整8
3.1.4波长的选择10
3.1.5柱温的选择11
3.2指纹图谱的相似度比较及差异分析11
4实验结果分析和展望11
参考文献12
致谢14
三黄片HPLC指纹图谱的研究
1 序言
中药由于其成分的复杂性和作用的整体性、系统性[1],而难以通过指标成分的测定进行有效地鉴别和评价。
要实现中药研究“基本讲清药效成分,基本讲清作用机理”[2]的目标,就需要对中药的整体性进行评价。
中药指纹图谱具有整体、宏观和半定量分析等特点,能够反应中药复杂成分内在质量的均一性和稳定性,成为目前国内外所广泛接受的一种中药评价技术[1]。
尤其对一些有效成分尚不明确,或即使已知其成分但仍无法与构效一致时,中药指纹图谱是目前最能反映药材性质,并得到国际上认可的方法之一[3]。
中药指纹图谱的评价系统[4]是指将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较,从而对药品质量进行评价和控制。
中药指纹图谱的评价[5]不同于定量分析,它强调的是相似性(Similarity),而不是相同性(Identity),分析比较的结果是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。
相似性的比较可以用相似度表达,相似度就是借助国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”计算,一般情况下[4]相似度在0.9~1.0之间即认为符合要求。
高效液相色谱(HPLC)具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点,且HPLC不受样品挥发度和热稳定性的限制,适用范围广。
利用HPLC非常适合构建中药指纹图谱。
三黄片的处方源于东汉时期医圣张仲景所著《金匮要略》中“泻心汤”一方,历经千年而不衰。
该方由大黄、黄芩、黄连三药组成,故名“三黄”[6]。
河北邯郸制药厂于1958年在大量研究的基础上将该方由传统的汤剂改为片剂,名“三黄片”[7]。
该药为《中国药典》2005年版一部所收载[8]。
三黄片[9]主要由大黄(radixetrhizomerhei)、盐酸小檗碱(berberinehydrochloride)和黄芩浸膏(extractumscutellariae)组成。
辅料为淀粉、糊精、蔗糖、柠檬黄、明胶、桃胶、虫白蜡、二甲硅油。
具有清热解毒、泻火通便的功效,用于三焦热盛所致的目赤肿痛、口鼻生疮、咽喉肿痛、牙龈出血、心烦口渴、尿赤便秘,急性胃肠炎,痢疾等。
目前检索到的关于三黄片HPLC的研究大多为对成分含量的分析。
如冯看等[10],建立了四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量测定方法;何军等[11],建立了三黄片中盐酸小檗碱含量的HPLC测定方法;金玉[12],应用改进HPLC法测定了三黄片中黄芩苷的含量;祝忠民等[13],采用HPLC法同时测定了三黄片中的盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量;毛泉明等[14],建立了RP—HPLC法同时测定三黄片中黄芩苷、小檗碱、大黄素和大黄酚的含量。
对于三黄片的HPLC指纹图谱的研究,目前仅检索到一篇,张艳菊等[15],用甲醇超声提取后残渣再用甲醇溶解得供试液,采用Grace-C18(4.5mm×250mm,5µm)色谱柱,乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,在254nm检测波长下,分析时间110min,进行了不同厂家三黄片HPLC指纹图谱的比较。
得到了16个共有峰,相似度较好。
关于三黄片主要成分的HPLC指纹图谱的研究很多,如刘欣等[16],研究了大黄的HPLC指纹图谱;王龙虎等[17],以盐酸小檗碱为参照测定了黄柏药材及中药饮片的HPLC指纹图谱;肖丽和等[18],对黄芩属四种药材的HPLC指纹图谱进行了初步研究。
三黄片指纹图谱的研究有助于更好的评价其内在质量,提高中成药质量评价的技术水平和科技含量,有一定的必要性。
该研究可为进行药材植物资源的进一步开发利用提供参考数据,为中药的规范化、标准化、产业化和国际化提供科学的技术平台,对中药现代化的战略行动具有科学的指导意义。
三黄片价格便宜,疗效显著,应用广泛。
目前,全国有近200家企业生产三黄片[19],但尤为邯郸制药厂(现名邯郸摩罗丹药业股份公司)生产的的华山牌三黄片最地道,不但采用原料上成地道,而且工艺精湛,是唯一获得过国家银质奖的优质产品[20]。
作为邯郸市地方院校,对于邯药三黄片进行指纹图谱的研究,具有很强的必要性和可行性。
本论文主要从以下方面进行三黄片HPLC指纹图谱的研究:
三黄片供试品的制备,选定检测波长和柱温,以一定配比的流动相进行梯度洗脱,确定最佳色谱条件,从而建立三黄片的HPLC指纹图谱。
并在此基础上利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度计算。
2 实验部分
2.1仪器和药品
2.1.1实验仪器
LC-2010AHT高效液相色谱仪(岛津国际贸易有限公司);
SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);
KW5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);
PHS-3C型PH计(上海精密科学仪器有限公司);
AE240S型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)
2.1.2实验试剂
表1实验试剂
试剂
纯度
含量
厂名
甲醇
分析纯
≥99.5%
天津市红岩化学试剂厂
甲醇
分析纯
≥99.5%
西陇化工股份有限公司
乙腈
分析纯
≥99.9%
天津市光复精细化工研究所
纯净水
食用级
杭州哇哈哈集团有限公司
冰乙酸
分析纯
≥99.5%
天津市瑞金特化学品有限公司
磷酸
分析纯
≥85%
天津市瑞金特化学品有限公司
乙醇
分析纯
≥99.7%
天津市红岩化学试剂厂
丙酮
分析纯
≥99.5%
天津市红岩化学试剂厂
2.1.3实验用药品
本实验选用邯郸摩罗丹药业股份公司(原邯郸制药有限公司)生产的华山牌三黄片,对10个不同批次的药品进行分析,药品均购自邯郸市各零售药店。
药品批号如下:
1512;109286;109486;109488;109606;109609;109557;110003;110012;110048。
2.1.4标准品
大黄酸,大黄素,大黄酚,大黄素甲醚,盐酸小檗碱,均为自制。
2.2三黄片HPLC指纹图谱色谱的建立
2.2.1供试品的制备
取三黄片两粒,除去包衣,研细,精称0.25g于10ml容量瓶中,用甲醇-磷酸(100:
1)溶解并定容至刻度,在35℃下超声提取45min,超声后补足溶液至刻度,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为供试品溶液。
2.2.2色谱条件
色谱柱:
VPODSC18(150mm×4.6mm,5um);体积流量:
1.0ml/min;柱温:
30℃;检测波长280nm;进样量:
10ul;流动相:
甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱。
梯度洗脱条件见表2。
表2甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱条件
时间(min)
甲醇(%)
0.2%磷酸水(%)
0
5
7
22
24
31
33
44
50
60
65
70
5
15
30
43
43
50
50
58
78
85
90
90
95
85
70
57
57
50
50
42
22
15
10
10
2.2.3方法学考察及相似度计算
2.2.3.1精密度实验
取同一批号(1512)供试品在上述色谱条件和测定方法下,连续进样5次,用相似度软件进行相似度计算。
结果表明,指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致,其相似度均大于97%,符合指纹图谱研究技术的要求,实验的精密度良好。
相似度见表3。
表3精密度相似度
批号
S1
S2
S3
S4
S5
相似度
0.975
0.999
1.000
0.999
0.998
2.2.3.2重复性实验
取同一批号(1512)的五个不同样品,制成供试品溶液5份,在上述色谱条件和测定方法下分别进样检测,并用相似度软件进行相似度计算。
结果表明,指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致,其相似度均大于98%,符合指纹图谱研究技术的要求,实验的重复性良好。
相似度见表4。
表4重复性相似度
批号
S1
S2
S3
S4
S5
相似度
0.999
0.985
0.984
0.998
0.982
2.2.3.3稳定性实验
同一批号(1512)药品,制成供试品溶液,在上述色谱条件和测定方法下分别在0h、2h、4h、8h、10h、15h、20h、24h、36h进样检测,并用相似度软件进行相似度计算。
结果表明,指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致,其相似度均大于97%,符合指纹图谱研究技术的要求,样品稳定性良好。
相似度见表5。
表5稳定性相似度
时间/h
0
2
4
8
15
20
24
36
相似度
0.999
0.998
0.997
0.998
0.998
0.976
0.978
0.996
2.3批次药品的指纹图谱测定
按照选定的色谱条件对10个批次的三黄片供试品溶液进行指纹图谱检测。
用中药指纹图谱相似度计算软件进行相似度计算,对各个峰进行对比分析,确定19个共有峰,见图1。
各共有峰的保留时间和峰面积见表6。
相似度见表7。
图110批三黄片供试液HPLC指纹图谱共有模式
图2三黄片供试液HPLC对照指纹图谱
表6共有峰的保留时间与峰面积
编号
1
2
3
4
5
S1
239474.1
165007.9
2191663
140203.8
2570132
S2
289120.1
238247.3
2035225
153317
3909388
S3
305924.8
160390.5
2092031
231841
3379555
S4
249707.8
168204.8
2257415
168952
3727018
S5
271967.9
1095069
2163534
195250.3
3759341
S6
272309.3
200665.1
2167681
199914.6
3803043
S7
273653.1
398954.4
1883698
60019.98
3493397
S8
320867.3
240230
2334137
202555.1
3886898
S9
268556.4
228670.6
1992027
147176.8
3759109
S10
394411.8
747930.1
2867945
0
6188142
保留时间
2.227
5.377
6.505
7.352
10.67
对照指纹图谱
288599.3
364336.9
2198536
149923.1
3847602
峰面积RSD(%)
15.34
85.76
12.24
47.2
23.71
(表6续表)
编号
6
7
8
9
10
S1
867184.3
634299.3
1604508
3314180
16989190
S2
1001897
1136666
1244325
3069629
18278680
S3
868636.1
676182.4
1608663
3006380
17881530
S4
853243.2
661042.1
1738212
1796986
20439130
S5
1311566
984296.6
2101357
3699634
17593250
S6
983288.1
697159.4
1849649
3427602
19023990
S7
2230515
941147.9
1953562
1263679
19358460
S8
1171916
719330.6
1803071
3284907
20462630
S9
952516.9
765529.9
1587870
4363785
17927400
S10
2659533
1188885
2402226
3134072
17136880
保留时间
12.076
13.837
14.931
16.77
18.897
对照指纹图谱
1290030
840453.8
1789344
3036085
18509114
峰面积RSD(%)
49.11
24.53
17.78
29.43
6.82
(表6续表)
编号
11
12
13
14
15
S1
537328.4
4587648
264449.9
45864340
1258777
S2
250393.2
4796268
361387.2
47409510
980007.7
S3
176440.7
4287078
197097.4
43252020
907736.3
S4
237020.2
4761597
308457.3
46659740
889882.4
S5
1161931
7040948
612886.7
45635360
1622805
S6
235363.3
5161355
324365.9
46979150
961153.1
S7
313918.2
4819292
382945.8
50010740
1107828
S8
222403.2
4906296
369427.9
45289120
944284.1
S9
233074.9
4546649
310979.1
44501430
916664.3
S10
329037.1
6998212
578739.4
48791660
2285600
保留时间
22.099
24.282
26.819
29.199
32.471
对照指纹图谱
369691
5190534
371073.7
46439306
1187474
峰面积RSD(%)
80.04
19.1
35.16
4.29
37.66
(表6续表)
编号
16
17
18
19
S1
4290070
1442642
1843600
1406053
S2
5330834
1650478
2027783
1284971
S3
3799947
1317744
1853436
1328499
S4
3822604
1448133
1808992
1249110
S5
7345790
1740809
2322270
1486247
S6
4084955
1512788
1883481
2107991
S7
4093036
1272906
1473467
1067599
S8
4959238
1490933
2296844
1300189
S9
6371736
1492923
1933007
1151951
S10
10364190
2141466
2542780
1182937
保留时间
35.229
39.135
49.809
52.423
对照指纹图谱
5446240
1551082
1998566
1356555
峰面积RSD(%)
38.35
16.04
15.51
21.42
表710批样品的相似度
批号
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
相似度
0.990
0.993
0.992
0.992
0.987
0.991
0.993
0.993
0.987
0.984
2.4特征峰的指认
经过标准品的指认,其中9号峰为盐酸小檗碱成分的特征峰,在本色谱条件下,经过标准品进样,大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均为未开,在55min时出峰,由于峰的重叠导致出峰时间不尽相同,中药相似性软件对此处的峰并未按照共有峰处理。
经过指认,三黄片中大黄的主要存在成分是大黄素和大黄酸。
3讨论
3.1色谱条件的选择
3.1.1供试品制备条件的选择
根据三黄片中中药成分的性质[21],并参考相关文献[10-15],本实验采用超声提取的方法制备供试品溶液。
提取溶剂考察了:
甲醇、甲醇-水(70-30)、甲醇-水(50-50)、甲醇-磷酸(100:
1),乙醇、乙醇-水(70:
30)、乙醇-磷酸(100:
1),丙酮、丙酮-水(70:
30),丙酮-磷酸(100:
1),其中以甲醇-磷酸(100:
1)提取的供试品溶液出峰数目最多且峰高较大,故采用甲醇-磷酸(100:
1)为提取试剂。
提取时间考察了:
35min、45min、60min,其中45min和60min的供试品图谱相差不大,峰数和峰高均大于35min的,考虑到在不影响实验结果的前提下节约时间和能源,选用45min的提取时间。
3.1.2流动相的选择
预设色谱条件:
色谱柱:
VPODSC18(150mm×4.6mm,5um);体积流量:
1.0ml/min;柱温:
30℃;检测波长:
λ1=280nm,λ2=254nm;进样量:
10ul;梯度:
流动相一从5%到95%在100min进样时间内等梯度。
流动相的预处理:
0.45um微孔滤膜抽滤。
考察的流动相:
(1)甲醇-磷酸
表8甲醇-磷酸流动相的考察
流动相1
流动相2
图谱情况描述
甲醇
磷酸水溶液
0.05%
0.1%
0.2%
5%
峰高较小,75min后基线出现明显漂移
30min之前没有明显的峰出现,峰个数少
基线基本平稳,峰个数较多,峰形较尖
基线平稳,但峰高和峰个数减少
(注:
图谱情况描述均以λ1=280nm为准)
(2)甲醇-冰乙酸
表9甲醇-冰乙酸流动相的考察
流动相1
流动相2
图谱情况描述
甲醇
冰乙酸水溶液
0.05%
0.1%
0.2%
3%
峰宽较大,峰分离不明显,后期基线漂移严重
峰宽较大,峰分离不明显
峰宽较大,峰分离不明显,后期基线漂移显著
峰个数较多,峰形较尖,70min后出现基线漂移
(3)乙腈-磷酸
表10乙腈-磷酸流动相的考察
流动相1
流动相2
图谱情况描述
乙腈
磷酸水溶液
0.1%
0.2%
峰宽较大,后期基线漂移严重、峰无法达到分离
峰宽较大,峰无法达到分离,后期尤为显著
(4)乙腈-冰乙酸
表11乙腈-冰乙酸流动相的考察
流动相1
流动相2
图谱情况描述
乙腈
冰乙酸水溶液
0.1%
0.2%
3%
峰宽较大,峰分离不明显
峰宽较大,峰高较小,后期基线漂移严重
峰形较尖,但后期基线漂移严重
综上
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