沉淀蛋白质地常用方法.docx
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沉淀蛋白质地常用方法
沉淀蛋白质的常用方法(TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤)
2010-08-1815:
19
TCA-DOC
Forprecipitationofverylowproteinconcentration
1)Toonevolumeofproteinsolution,add1/100vol.of2%DOC(Nadeoxycholate,detergent).
2)Vortexandletsitfor30minat4oC.
3)Add1/10ofTrichloroaceticacid(TCA)100%vortexandletsitONat4oC(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,usegloves!
!
!
).
4)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).[OPTION:
Washpellettwicerepelletsamples5minatfullspeedbetweenwashes].
5)Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryair.ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
NormalTCA
ToeliminateTCAsolubleinterferencesandproteinconcentration
1)ToasampleofproteinsolutionaddTrichloroaceticacid(TCA)100%toget13%finalconcentration.Mixandkeep5min–20oCandthen15min4oC;orlongertimeat4oCwithoutthe–20oCstepforlowerproteinconcentration.Suggestion:
leaveONiftheproteinconcentrationisverylow.
(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,usegloves!
!
!
).
2)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
3)ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
AcetonePrecipitation
Toeliminateacetonesolubleinterferencesandproteinconcentration
1)Add1volumeofproteinsolutionto4volumesofcoldacetone.Mixandkeepatleast20min–20oC.(Suggestion:
leaveONiftheproteinconcentrationisverylow).
2)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
3)Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.
EthanolPrecipitation
UsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidineHydrochloridebeforePAGE-SDS
1)Addto1volumeofproteinsolution9volumesofcoldEthanol100%.Mixandkeepatleast10min.at–20oC.(Suggestion:
leaveON).
2)Spin15min4oCinmicrocentrifugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
3)Washpelletwith90%coldethanol(keepat–20oC).Vortexandrepelletsamples5minatfullspeed.
4)Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryairtoeliminateanyethanolresidue(smelltubes).ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.
TCA-DOC/Acetone
UsefulmethodtoconcentrateproteinsandremoveacetoneandTCAsolubleinterferences
1.Toonevolumeofproteinsolutionadd2%Nadeoxycholate(DOC)to0.02%final(for100μlsample,add1μl2%DOC).
2.Mixandkeepatroomtemperatureforatleast15min.
3.100%trichloroaceticacid(TCA)toget10%finalconcentration(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,usegloves!
!
!
).
4.Mixandkeepatroomtemperatureforatleast1hour.
5.Spinat4oCfor10min,removesupernatantandretainthepellet.Drytubebyinversionontissuepaper.
6.Add200μloficecoldacetonetoTCApellet.
7.Mixandkeeponiceforatleast15min.
8.Spinat4oCfor10mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.
9.Removesupernatantasbefore(5),dryairpellettoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.
10.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
AcidifiedAcetone/Methanol
UsefulmethodtoremoveacetoneandmethanolsolubleinterferenceslikeSDSbeforeIEF
1)Prepareacidifiedacetone:
120mlacetone+10μlHCl(1mMfinalconcentration).
2)Prepareprecipitationreagent:
Mixequalvolumesofacidifiedacetoneandmethanolandkeepat-20oC.
3)Toonevolumeofproteinsolutionadd4volumesofcoldprecipitationreagent.MixandkeepONat-20oC.
4)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
5)Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneormethanolresidue(smelltubes).
TCA-EthanolPrecipitation
UsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidineHydrochloridebeforePAGE-SDS
1)Dilute10-25μlsamplesto100μlwithH2O
Add100μlof20%trichloroaceticacid(TCA)andmix(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,usegloves!
!
!
).
2)Leaveinicefor20min.Spinat4oCfor15mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.
3)Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissue(pelletmaybedifficulttosee).
4)Washpelletwith100μlice-coldethanol,dryandresuspendinsamplebuffer.
5)IncasetherearetracesofGuHClpresent,samplesshouldbeloadedimmediatelyafterboilingfor7minat95°C
6)(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichmentKit-PIERCE
ThePAGEprep?
KitenablesremovalofmanychemicalsthatinterferewithSDS-PAGEanalysis:
guanidine,ammoniumsulfate,othercommonsalts,acidsandbases,detergents,dyes,DNA,RNA,andlipids.
PIERCE:
#26800-PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichmentKit(pdf)
ChloroformMethanolPrecipitation
UsefulmethodforRemovalofsaltanddetergents
1)Tosampleofstartingvolume100ul
2)Add400ulmethanol
3)Vortexwell
4)Add100ulchloroform
5)Vortex
6)Add300ulH2O
7)Vortex
8)Spin1minute@14,0000g
9)Removetopaqueouslayer(proteinisbetweenlayers)
10)Add400ulmethanol
11)Vortex
12)Spin2minutes@14,000g
13)RemoveasmuchMeOHaspossiblewithoutdisturbingpellet
14)Speed-Vactodryness
15)Bringupin2XsamplebufferforPAGE
Reference:
Wessel,D.andFlugge,U.I.Anal.Biochem.(1984)138,141-143
哈哈,我做过这个论文哈!
1.配胶缓冲液系统对电泳的影响?
在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。
2.样品如何处理?
根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:
还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1)还原SDS处理:
在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。
2)带有烷基化作用的还原SDS处理:
碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。
3)非还原SDS处理:
生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。
3.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?
聚丙烯酰胺的作用:
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;
制胶缓冲液:
浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,TEMED与AP:
AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基硫酸钠(SDS):
阳离子去污剂,作用有四:
去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
4.提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?
聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。
建议做法:
待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
5.“微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因?
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。
处理办法:
待其充分凝固再作后续实验。
6.“皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法:
可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。
7.为什么带出现拖尾现象?
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法:
加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。
8.为什么带出现纹理现象?
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法:
加样前离心;加适量样品促溶剂。
9.什么是“鬼带”,如何处理?
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。
但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法:
在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
10.为什么溴酚蓝不能起到指示作用?
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法:
更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
11.为什么电泳的条带很粗?
电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。
处理办法:
适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;
12.为什么电泳电压很高而电流却很低呢?
这种现象一般初学者易出现。
比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。
主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。
包括:
a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。
处理办法:
电泳槽正确装配即可。
13.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?
这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。
14.凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?
通常胶在30MIN-1H内凝。
如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。
APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。
如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。
15.电泳时间比正常要长?
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。
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- 沉淀 蛋白 质地 常用 方法