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67精液的保存与运输
精液的保存与运输
精液保存的目的是为了延长精子的存活时间,便于运输。
扩大精液的使用范围,增加受配母畜头数。
现行的精液保存方式有三种,常温(15~25℃)保存、低温(0~5℃)保存和冷冻(-196~-79℃)保存。
(一)常温保存
常温保存的温度在15~25℃,温度允许有一定变动,所以又称为变温保存或室温保存。
常温保存所需的设备简单,便于普及推广,特别适合猪的精液保存(表5—4)。
1.原理
利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动,以减少其能量消耗,使精子保持在可逆的静止状态而不丧失受精能力。
一般将pH调整到6.35左右,为使稀释液的pH达到所需范围,通常采取三种方法。
(1)向稀释液中充入二氧化碳,如伊利尼变温稀释液(IVT)。
(2)利用精子本身在代谢中产酸,自行调节pH,如康奈尔大学稀释液(CUE)。
(3)向稀释液中加入有机酸,如乙酸稀释液(CME)。
2.常温保存的稀释液
常温保存的稀释液除能降低pH,使精子代谢减慢外,还能给精子补充足够的养分,同时加入抗菌物质抑制细菌生长和繁殖。
另外,还在稀释液中加人缓冲物质,加入明胶以阻碍精子运动(表4-5)。
。
牛精液冷冻保存已十分普及,常温保存方式多不采用。
马、绵羊精液常温保存效果较好。
如果采用明胶稀释液,在10~14℃下呈凝固状态保存,绵羊精液可保存48h以上,马的精液可保存120h以上,精子活力接近0.5(表4-6)。
猪的精液常温保存效果好。
在精液稀释后,按一个输精量分装到特定的瓶(管)中,封口,贴好标签后放入17冰箱内保存。
表4一5猪精液常温保存稀释液
成分
葡萄糖液
葡萄糖、
柠檬酸钠液
氨基乙酸
卵黄液
葡萄糖、柠檬酸钠、
乙二胺四乙酸液
蔗糖、奶粉液
英国变温稀释液
葡萄糖、
碳酸氢钠、卵黄液
葡-
柠-
乙-
卵黄液
基础液:
二水柠檬酸钠(g)
碳酸氢钠(g)
氯化钾(g)
葡萄糖(g)
蔗糖(g)
氨基乙酸(g)
乙二胺四乙酸(g)
奶粉(g)
氨苯磺胺(g)
蒸馏水(m1)
—
—
—
6.0
—
—
—
—
—
100
O.5
—
—
5.O
—
—
—
—
—
100
—
—
—
5.0
—
3.0
—
—
—
100
O.3
—
—
5.0
—
—
O.1
—
—
100
—
—
—
—
6.O
—
—
5.0
—
100
2.0
0.21
0.04
O.3
—
—
—
—
0.3
100
—
O.21
—
4.29
—
—
—
—
—
100
O.18
0.05
—
5.1
—
—
O.16
—
—
100
稀释液:
基础液:
卵黄(容量%)
lO%安钠咖(容量%)
青霉素(IU/m1)
链霉素(µg/m1)
100
—
—
1000
1000
100
—
—
1000
1000
70
30
—
1000
1000
95
5.0
—
1000
1000
96
—
4.0
1000
1000
100
—
—
1000
1000
80
20
—
1000
1000
97
3.O
—
500
500
注:
通人C02使pH达到6.35。
表4—6马、绵羊精液常温保存稀释液
成分
绵羊
马
RH明胶
明胶、羊奶液
明胶、蔗糖液
葡萄糖、甘油卵黄液
马奶液
基础液:
二水柠檬酸钠(g)
蔗糖(g)
葡萄糖(g)
磺胺甲基嘧啶钠(g)
后莫氨磺酰(g)
明胶(g)
羊奶(ml)
马奶(ml)
蒸馏水(ml)
稀释液:
基础液(容量%)
甘油(容量%)
卵黄(ml)
青霉素(IU/ml)
双氢链霉素(μg/m1)
3
—
一
0.15
0.1
10
—
—
100
100
—
—
1000
1000
—
—
—
—
—
10
100
—
—
100
—
—
1000
1000
—
8
—
—
—
7
—
—
100
90
5
5
1000
1000
—
7
7
一
—
一
—
—
100
97
2.5
0.5
l000
1000
—
—
—
—
—
—
—
100
—
99.2
—
0.8
1000
1000
(二)低温保存
低温保存是将稀释后的精液置于0℃~5℃的环境中保存。
各种家畜的精液都可进行低温保存,绵羊精液低温保存在1d左右,马的精液不过几天。
马、绵羊由于精液本身特性季节配种的影响以及这方面研究工作不足等原因,采用低温保存效果尚不理想。
由于猪精液常温保存的效果更好,故一般都不采用低温保存。
1.原理
低温保存主要是向稀释液中添加抗冷物质,防止精子发生冷休克,通过缓慢降低温度,使精子的代谢活动减慢,当温度降至0℃~5℃时,精子几乎处于休眠状态,物质代谢和能量消耗均降到较低水平,废物累积减少,且此温度下不利微生物的繁殖,可达到保存目的。
当温度回升后,精子又逐渐恢复正常代谢机能并不丧失受精能力。
2.低温保存的稀释液
低温保存常在马、绵羊的精液保存中应用,稀释液配方如表5—5。
表5—5马、绵羊精液低温保存的稀释液
成分
绵羊
马
葡萄糖、
柠檬酸钠、
卵黄液
柠檬酸钠、
氨基乙酸液
奶粉、
卵黄液
奶粉、
葡萄糖、
卵黄液
葡萄糖、
酒石酸钾
钠、卵黄液
马奶、
卵黄液
基础液:
二水柠檬酸钠(g)
葡萄糖(g)
氨基乙酸(g)
酒石酸钾钠(g)
马奶(m1)
奶粉(g)
蒸馏水
2.8
O.8
—
—
—
—
100
2.7
—
0.36
—
—
—
100
—
—
—
—
—
10
100
—
7
—
—
—
10
100
—
5.76
—
0.67
—
—
100
—
—
—
—
100
—
—
稀释液:
(容量%)
基础液:
卵黄(容量%)
青霉素(IU/ml)
链霉素(µg/m1)
80
20.O
1000
1000
100
—
1000
1000
90
10.0
1000
1000
92.O
8.0
1000
1000
95.O
5.O
1000
1000
95.O
5.0
1000
1000
3.方法
应采取逐步降温的方法,并使用含有卵黄的稀释液,以防冷休克发生。
首先将稀释后的精液按照一个输精量(羊10~20个输精量)分装到试管中,封口,再包以数层脱脂棉或纱布,最外层用塑料袋扎好,防止水分渗入。
把包装好的精液放到0℃~5℃的低温环境中,经1~2h精液即降至0℃~5℃。
在保存过程中,要维持温度的恒定,防止升温。
在特殊情况下或运输,可用广口保温瓶,在保温瓶中加入占容积80%的冰块,把包装好的精液放到冰块上,盖好。
注意定期添加冰源,如无冰源,可采用化学制冷法,在冷水中加入一定量的氯化铵或尿素,可使水温达到2~4℃。
(三)精液冷冻保存
精液冷冻保存是利用液氮(-196℃)作冷源,将精液处理后冷冻起来,达到长期保存的目的。
精液冷冻保存是人工授精技术的重大进步,使输精不受时间、地域和种畜生命的限制,从而加快了家畜品种的育成和改良速度。
家畜冷冻精液保存技术发展很快,特别是牛最为显著,绵羊冷冻精液已在我国新疆、内蒙古等地大规模使用,受胎效果良好。
至于猪、山羊及其他家畜的冷冻精液,尚处于试验改进阶段,原因是由于受胎率偏低,个体差异大。
1.冷冻保存的原理
精子在超低温条件下,其代谢活动几乎停止,以生命相对静止状态保存下来,升温后又能复苏而不丧失受精能力。
关于精液在冷冻过程中为什么没有死亡,复苏后仍具有活力,可谓众说纷纭,一直没有定论,其中比较公认的是玻璃化假说。
玻璃化假说认为,物质的存在形式有三种,即气态、液态和固态,其中固态又分为结晶态和玻璃态。
这两种形式在不同的温度下可以相互转化。
当气体的温度逐渐下降时,越过沸点即转变为液体;当温度进一步下降而越过熔点时,液态又转变为固态。
当温度逐渐下降时,所形成的固体为结晶态(分子有序排列,颗粒大而不均匀)。
如果液体的温度迅速下降并越过某一区域,所形成的固体为玻璃态(分子无序排列,颗粒细小而均匀)。
反之,当温度缓慢升高时,玻璃态先变成结晶态,再成为液体;如果快速升温,则玻璃态就可以跨过结晶态直接变为液体。
精子在冷冻过程中应尽可能形成玻璃化,防止精液形成大的冰晶。
因为冰晶的形成是造成精子死亡的主要物理因素。
首先,精子外水分在形成冰晶过程中引起溶液不同部分渗透压的改变,精子内外溶液浓度差增大,精子膜内溶质浓度升高,造成精子脱水,原生质变干而死亡。
其次,精子水分形成冰晶后体积增大、形状不规则,致使原生质受不同程度的损伤,同时由于溶液中冰晶的形成破坏精子膜结构,引起精子死亡。
精液经过特殊处理后在超低温下形成玻璃化。
玻璃化中水分子保持原来无序排列,呈现纯粹的超微颗粒结晶。
精子在玻璃化冻结状态下避免了原生质脱水,膜结构也不受到破坏,解冻后仍可恢复活力。
经试验证明,-60℃~O℃是冰晶形成的低温区域,而且是在缓慢降温的条件下形成的,降温越慢,冰晶形成越大,-25~-15℃是形成冰晶最危险的区域。
玻璃化必须在-25℃~-60℃超低温区域内形成,而且从冰晶化区域内开始就以较快速度降温,迅速进入玻璃化阶段。
基于以上原理,冷冻精液制作使用中,无论是升温还是降温,都必须采取快速越过对精子危害的冰晶化温区。
虽然冷冻精液已制作成功而且在生产中得以广泛应用,但仍达不到完全玻璃化程度,在冷冻过程中有30%~50%的精子死去。
因此,向稀释液中添加抗冻物质甘油以增强精子的抗冻能力,并对防止冰晶发生起着重要作用。
甘油渗入精子内部使部分水分和盐类排出,避免了电解质浓度增加的不良影响。
甘油浓度过高时,对精子有危害作用,如伤害精子的顶体和颈部,使尾部弯曲,破坏某些酶类等,从而影响精子的活力和受精能力,一般牛冷冻精液中甘油的加入量在5%~7%。
2.冷冻技术(以牛的冻精生产为例)
(1)采精及精液品质检查。
精液品质的优劣直接关系到冷冻后效果,做好采精的准备和操作,争取获得优质的精液。
用于冷冻保存的精液,活力不低于0.6,密度在8亿/ml以上。
(2)精液稀释。
根据冻精的种类、分装剂型及稀释倍数的不同,精液的稀释方法也不相同,现生产中多采用一次稀释法或两次稀释法(表5—6)。
①一次稀释法。
将含有甘油、卵黄等的稀释液按一定比例加入精液中,常用于制作颗粒冷冻精液的稀释。
②两次稀释法。
为避免甘油与精子接触时间过长而造成的危害,常采用两次稀释法,也就是将精液分两次稀释。
首先用不含甘油的稀释液(第一液)对精液进行最后稀释倍数的半倍稀释,然后把稀释后的精液连同第二液一起降温至0~5℃,并在此温度下进行第二次稀释。
表5—6牛冷冻精液和稀释液
成分
乳糖、卵黄、甘油液
蔗糖、卵黄、甘油液
葡萄糖、卵黄、甘油液
葡萄糖、柠檬酸钠、
卵黄、甘油液
第一液
第二液
基础液:
蔗糖(g)
葡萄糖(g)
乳糖(g)
二水柠檬酸钠(g)
蒸馏水(m1)
—
—
11
—
100
12
—
—
—
100
—
7.5
—
—
100
—
3.0
—
1.4
100
稀释液:
基础液(容量%)
卵黄(容量%)
甘油(容量%)
青霉素(IU/m1)
双氢链霉素(µg/m1)
75
20
5
1000
1000
75
20
5
1000
1000
75
20
5
1000
1000
80
20
—
1000
1000
86
—
14
0
O
(3)降温平衡。
采用一次稀释法,降温是从30℃经1~2h缓慢降至0~5℃,以防冷打击。
平衡是降温后,把稀释后的精液放置在0~5℃的环境中停留2~4h,平衡的目的是使精子有一段适应低温的过程,同时使甘油充分渗入精子内部,达到抗冻保护作用。
(4)精液的分装。
冷冻精液现多采用颗粒和细管两种剂型。
①颗粒冻精。
将精液直接滴在经液氮制冷的金属网或塑料板上,冷冻后制成0.1~0.2ml的颗粒。
制作颗粒冷冻精液具有操作简便、体积小、成本低、便于贮存的优点。
但也有易受污染、不便标记、不易识别的缺点。
②细管冻精。
把平衡后的精液用自动灌装机分装到塑料细管中,细管的一端塞有细线团或棉花,其间放置少量聚乙烯醇粉(吸水后形成活塞),另一端封口,冷冻后保存。
细管的长度约13cm,容量有0.25ml和0.5ml。
细管冷冻精液不易污染、便于标记、容量小、易贮存、冷冻效果好,适合于机械化生产,是最理想的使用剂型。
细管冷冻精液标记方法。
细管冷冻精液标记由十六位数四部分组成,排列顺序如下:
a)第一部分三位数:
公牛站代号(全国种公牛站统一编码表);
b)第二部分二位数:
品种代号(GB/T4143);
c)第三部分六位数:
冻精生产日期按年月日次序排列;
d)第四部分五位数:
公牛号取该牛身分证号码的后五位数。
部分与部分之间空一个汉字(二个字节)。
标记的字迹必须清晰易认。
标记示例:
棉塞封口端641HS04051896188超声波封口端
“641”为宁夏回族自治区家畜繁育中心编码号;“HS”为荷斯坦种公牛的品种代号;
“040518”为2004年5月18日的生产日期;“96188”为该公牛身份证号码HS64196188的后五位数。
(5)冻结过程
①颗粒冻精冷冻。
在广口液氮桶上安装铜纱网,调至距液氮面1~3cm,预冷几分钟后,使纱网附近温度达到-100~-80℃,将精液均匀地滴在铜纱网上,经2~4min,待精液完全冻结,颜色变浅发亮时,用小铲轻轻铲下颗粒冻精,每50~100粒装入纱布袋中,沉入液氮保存。
②细管冻精冷冻。
采用液氮熏蒸法。
把分装好的精液细管平铺于特制的细管屉上,放入大口径液氮罐中盖好,熏蒸8min后打开盖子,为避免细管棉塞端爆脱的发生,将细管的封口端朝上.棉塞端向下,装入拇指管,并迅速浸泡在液氮中,冻精按牛号投入不同的提筒中,沉入液氮保存。
(6)冻精解冻
冷冻精液的解冻温度、解冻方法都直接影响精子解冻后的活力。
也是输精前必须的准备工作。
方法有低温冰水解冻(0~5℃)、温水解冻(30~40℃)和高温解冻(50~70℃)等。
经实践证明,温水解冻,特别是38~40℃解冻效果最好。
解冻后进行镜检并观察精子活力,活力在0.3以上方能用于输精。
3.冷冻精液的贮存与运输
目前,普遍使用液氮灌贮存和运输冻精。
一般的人工授精站适宜用10~30L的中型罐和3~6L的小型罐用来输送精液。
(1)液氮及其特性。
液氮是空气中的氮气经分离、压缩形成的一种无色、无味、无毒的液体,沸点温度为-195.8℃,在常温下液氮沸腾,吸收空气中的水汽形成白色烟雾。
液氮具有很强的挥发性,当温度升至18℃时,其体积膨胀680倍。
此外,液氮又是一种不活泼的液体,渗透性差,无杀菌能力。
根据液氮有上述特性,使用时要注意防止冻伤、喷溅、窒息等,用液氮量大时要保证室内空气通畅。
(2)液氮容器。
包括液氮贮运容器和冻精贮存容器。
液氮贮存容器是贮存和运输液氮用,冻精贮存容器是专门保存冻精用。
当前专门保存冻精用的液氮罐型号较多,但其结构是相同的。
①罐壁。
分为内、外两层,一般由坚硬的合金制成。
为了增加罐的保温性,夹层被抽成真空,真空度为133.3×10-6Pa。
在夹层中装有活性炭、硅胶及镀铝涤纶薄膜等,以吸收漏人夹层的空气,从而增加了罐的绝热性。
②罐颈。
由高热阻材料制成,是连接罐体和罐壁的部分,较为坚固。
③罐塞。
由绝热性好的塑料制成,具有固定提筒手柄和防止液氮过度挥发的功能。
④提筒。
用来存放冻精和其他生物制品。
提筒的手柄由绝热性良好的塑料制成,既能防止温度向液氮内传导,又能避免取冻精时冻伤。
提筒的底部有许多小孔,以便液氮渗入其中。
根据液氮罐的性能要求定期添加液氮。
罐内盛装冻精的提筒不能暴露在液氮外,从液氮罐取出冷冻精液时,提筒不得提出液氮罐口外,可将提筒置于罐颈下部。
将冻精向另一容器转移时,动作要迅速。
液氮罐在使用中要防止撞击、倾倒,定期刷洗保养。
为保证贮精效果,要定期检查液氮的消耗情况,当液氮减少2/3时,需及时补充。
4、冷冻精液的运输
精液的运输有远有近,要根据不同的距离、不同的运输量,采用适当的运输工具与运输方法。
一般远距离运输及运输量相对较大时,应用专用车辆、专用液氮罐进行运输,近距离运输则可将冻精解冻后在低温保存状态下进行运输。
运输时,要注意以下几个问题:
(1)应有专人负责,要确保盛装冻精的液氮灌性能良好,运输前装满液氮,容器外应有保护套。
(2)应将装运冻精的容器拴系牢靠,四周最好用柔软材料铺塞,要防止颠簸与振荡,运输过程中要随时注意检查液氮情况及运输容器的安全状态。
。
(3)运输过程中要避免阳光照射或与热源接触,防止升温。
(4)要尽量缩短运输的时间。
装卸时要轻拿轻放
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