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浅析植物离体快繁中常见的问
绪论…………………………………………………………………………………………………………………………。
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1.离体快繁过程中的问题、原因及防治措施………………………………………………………………………。
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1。
1污染问题…………………………………………………………………………………………………………….2
1。
1.1污染的来源……………………………………………………………………………………………….2
2。
1.2污染的防治措施………………………………………………………………………………………….2
1.2褐变问题…………………………………………………………………………………………………………….。
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1。
2。
1褐变的原因………………………………………………………………………………………………..4
1.2.2克服外植体褐变的措施………………………………………………………………………………..4
1.3玻璃化问题………………………………………………………………………………………………………….4
1。
3。
1玻璃化发生的原因………………………………………………………………………………………4
1。
3.2控制组培苗玻璃化的措施………………………………………………………………………………。
5
1。
4遗传稳定性………………………………………………………………………………………………………….5
1.4。
1影响遗传稳定性的因素……………………………………………………………………………….。
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1。
4.2提高遗传稳定性,减少变异的措施……………………………………………………………….。
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1.5黄化问题……………………………………………………………………………………………………………..5
1。
5。
1黄化原因……………………………………………………………………………………………………6
2.离体快繁的前景与探讨…………………………………………………………………………………………………。
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2.2适应现状的需求………………………………………………………………………………………………………6
2.3存在问题………………………………………………………………………………………………………………。
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参考文献………………………………………………………………………………………………………………………….6
致谢…………………………………………………………………………………………………………………………………6
浅析植物离体快繁中常见的问题
摘要
植物组织培养是20世纪初发展起来的一项新技术,是现代农业生物技术的一个重要组成部分,已经日益广泛地应用于园艺植物的脱毒和快繁等方面。
本文针对植物组织培养中常出现的问题进行了分析,探讨了污染、褐变、玻璃化、遗传稳定性、黄化等发生的可能原因,并提出了相应的防治措施。
关键词
离体快繁;污染;褐变;玻璃化;遗传稳定性;黄化
AnalysisoftheCommonProblemsinPlantVitroPropagation
Pickto
Planttissuecultureisdevelopedintheearly20thcentury,anewtechnologyofmodernagriculturalbiotechnology,isoneoftheimportantconstituent,hasincreasinglywidelyappliedintheenviromentofhorticulturalplantsandrapidpropagation,etc。
Aimingattheplanttissuecultureoftenappearsthequestionwereanalyzed,pollution,Browning,vitrification,geneticstability,suchaspossiblereasonsBrowning,andputsforwardthecorrespondingpreventioncuo
Keywords
Propagationinvitro;contamination;browning;vitrification;geneticstability;etiolation
绪论:
植物组织培养是研究植物生长和分化规律的重要手段,是在人工控制条件下培养外植体再生器官或植株的技术,可以在不受植株体其它部分干扰下研究被培养部分生长和分化的规律,并可以利用各种培养条件影响它们的发育进程。
植物组织培养技术,作为现代生物技术的一个重要手段,已在很多领域得到了广泛的应用。
植物离体快繁可节约人力和物力,并可人为控制培养基中的各种成分和环境条件,全年均可连续试验和生产,因而近年来在农业上的应用十分广泛。
但是,在开展植物组培快繁技术研究和生产的过程中,我们发现有一些较常见的问题,有时会严重影响组培工作效率和进展,降低组培快繁的经济效益。
譬如遗传稳定问题、玻璃化问题、污染及褐化问题等。
因此,探讨植物离体快繁过程中常见的问题、分析其原因、提出有效的防治措施,是至关重要的。
1离体快繁过程中的问题、原因及防治措施
1.1污染问题
1。
1.1污染的来源
首先应考虑无菌操作的规范性,培养基接种工具消毒是否彻底。
在此基础上植物组培中的污染主要是真菌、细菌引起的污染。
真菌在培养条件下生长快,很容易观察到,而细菌潜伏期长,植物组织一般不表现症状,所以很难在前期和肉眼观察到。
国外有关学者认为细菌污染的来源主要有三个:
一是材料内部灭菌处理不好,这样造成的污染占污染总数的1/3~1/2。
二是在正常的灭菌的条件下,内生菌能够存活,这样的污染占污染源的1/4。
三是来自寄生植物的污染占1/4~1/2.同时认为有些植物的昆虫和螨虫的体表带有霉菌的孢子和细菌,在九、十月份是重要的污染源,因多种植物昆虫处在大量繁殖阶段,此时大量昆虫造成的污染源最易造成组培污染的严重发生.近六年来,我们通过对猕猴桃、樱桃、托柄菝葜及大花非洲菊初级培养污染的研究中发现,高温、多雨的环境更有利于污染的发生,而且随着植物材料年龄的增长,植物材料的健康状况不断恶化,组培污染也会更加严重。
另外,外植体的状况,环境条件和操作过程也是引起污染的主要原因。
2.1.2污染的防治措施
首先严格保证无菌操作的规范性,对培养基接种工具及接种室的严格消毒处理.
然后
(1)抗生素对细菌污染的防治。
植物组培污染的控制取决于灭菌技术、灭菌设备、外植体年龄和环境条件等许多方面。
尽管在植物组培过程中尽量使无菌条件更完善,但是污染还是经常发生,甚至有时整个实验室的组培苗部分污染或全部死亡,这是无法挽回的巨大损失,因此人们对细菌污染研究的较多。
细菌污染的消除有些研究人员希望用抗生素防治,抗生素可以直接加入到培养基中,也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体.但植物种类不同,所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同,还有的抗生素对污染消除根本不起作用,因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。
一般情况下,为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗,可在培养基中加入氨中噻肟头孢菌素、四环素、利福平和多粘菌素B分别以25mg/L、25mg/L、6mg/L和6mg/L浓度的混合物,可使细菌完全被消除。
另外,用头孢菌素Ⅱ和链霉素消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。
总之针对不同植物品种要想找到一种合适的抗生素处理组合是比较困难的,工作也较繁琐。
国内外有关学者都认为没有一种抗生素对所有的细菌都有效,即使有效,抗生素消除植物组培污染的方法也是暂时的解决方案,如果长期使用抗生素消除污染,必然对组培苗的生长、分化和生根造成一定的影响。
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(2)真菌污染的防治。
抗生素消除细菌的研究比较多,但目前酵母菌污染的研究相对较少,GBPoulsen等在苹果砧分裂组织微生物消除的研究中,测试了几种物质对酵母菌的毒性,虽然它们对植物材料都没有伤害,但是没有一种能够消除酵母菌。
胍类化合物是对两种酵母菌有毒的唯一复合物,但它对分裂组织有毒害作用。
霉菌污染的一个重要特点是迅速,难控制.目前,关于霉菌污染的研究还很少,有人建议用防腐剂消除霉菌污染,但是还未见报到。
(3)常用防治污染方法。
目前外植体表面灭菌的方法除常规的氯化汞、双氧水、酒精和次氯酸钠外,用于厕所消毒的家净也是一种良好的表面杀菌剂。
GRreustle等学者在对葡萄组织培养污染的研究中发现家净表面消毒效果很好,家净虽然效果极好,价格便宜,但内生菌潜伏期长,内寄生性强,危险性大,对内生菌而言,任何一种表面消毒剂对外植体的内生菌几乎都是无能为力的,除了在培养基中加入杀菌剂消除植物组培污染外,还有许多其他的方法减少污染,如用抗微生物药剂定期喷洒活植物新梢、在新梢或发芽期套袋法隔绝微生物的侵入等方法来获得外植体接种消毒成功率。
另外,培养环境和接种环境的各处不同,灭菌的方法以及新型杀菌设备的应用在植物组培污染中也起着一定的重要作用。
1.2褐变问题
1.2。
1褐变的原因
褐变是材料在接种后,材料表面出现褐色物质甚至培养基也呈褐色的现象.在完整的植物体细胞中,酚类化合物与多酚氧化酶是分隔存在的,切割外植体使其受到创伤刺激,受伤细胞内的酚类化合物和多酚氧化物便流出,酚类化合物被多酚氧化物氧化成褐色的醌类物质和水。
醌类物质又会和酪氨酸酶发生作用使外植体蛋白质聚合,导致外植体生长停顿,直至死亡。
许多植物尤其是木本植物组织中含有较多的酚类化合物,褐变现象比较严重。
影响外植体褐变的因子主要有:
外植体酚类物质的含量、PPO活性上的差异、外植体的大小、培养基的成份、激素类型等。
1。
2.2克服外植体褐变的措施
在植物组织培养中,一般都是从培养基的组成,如培养基的无机盐成份、蔗糖浓度、添加的激素的种类和浓度、加入吸附剂活性炭或PVP(聚乙烯吡咯烷酮)等来防治外植体褐化。
(1)选择适当的外植体
不同时期和年龄的外植体在培养中褐变的程度不同,选择适当的外植体是克服褐变重要手段。
避免在夏季高温季节取材,选择幼苗、褐变程度轻的品种和部位作为外植体.
(2)外植体预处理
对较易发生褐变现象的外植体可采取一些措施进行预处理,即先用流水冲洗外植体,然后放置在5℃左右的冰箱中低温处理12~14h。
消毒后先接种到只含蔗糖的琼脂培养基中培养3~7d,使组织中的酚类物质部分渗入培养基中,取出外植体用0。
1%的漂白粉溶液浸泡10min,然后再接种到合适的培养基上.
(3)筛选合适的培养基和培养条件
降低培养基中的盐浓度,减少BA和KT的使用,采取液体培养,初期在黑暗或弱光条件下培养,保持较低温度(15~20℃)也是降低褐变的有效方法。
(4)添加抗氧化剂和系缚剂
在培养基中添加抗氧化剂,或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养,可预防醌类物质的形成,对易发生褐变的植物材料培养有很好的辅助作用。
常用的抗氧化剂有抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、硫代硫蛋白等.另外,添加1-5g/L的活性炭对酚类物质的吸附效果也很明显。
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(5)连续转移
对易发生褐变的植物,在外植体接种后1~2d立即转移到新鲜培养基上,可减轻酚类物质对培养物的毒害作用,连续转移多次基本解决外植体的褐变问题。
1。
3玻璃化问题
1.3.1玻璃化发生的原因
(1)琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关,琼脂或蔗糖浓度越高,玻璃苗的比率越低。
Daniel G. W.
Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致.碳源不仅为芽的形成提供能量,而且也起渗透调节作用.随琼脂浓度及纯度的增加,培养基硬度增加,从而影响其衬质势和水分状况。
(2)试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。
Debergh等研究表明,液体培养基的水势影响玻璃苗的形成,Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度,就可以降低玻璃苗的比例。
刘思颖等(1988)测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍,含水量为正常苗的2。
09-2.21倍。
自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。
Davis等研究表明,液体培养是导致玻璃化的主要原因。
(3)许多学者证明玻璃化与培养基中BA浓度和培养温度成正相关,BA浓度越高或培养温度越高,玻璃苗比率越大.Debergh曾用14C—KT研究表明,随琼脂浓度的增加,KT利用率降低。
同时也证明,随BA浓度的增加,玻璃化率增加。
Bornman等用14C-BA研究表明,14C-BA的积累与不定芽分化和玻璃化是同步的。
玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长,而GA3也有类似效应,也许GA3促进了细胞过度生工,从而导致玻璃化。
生长素可以改变细胞壁的机械特性,使其具有更大的可塑性。
(4)许多研究表明,玻璃化被认为是一种非受伤协迫条件下形态上的反应。
玻璃苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性低于正常植株。
在协迫条件下乙烯的快速合成,又通过抑制氨基环丙烷羧酸(ACC)酶的形成,对乙烯起反馈调节作用。
通过改善气体交换防止玻璃化形成,可能与克服乙烯反馈抑制有关.一种与膜有关的过氧化物酶直接或间接掺入ACC合成乙烯。
现已证明,IAA-氧化酶体系至少在乙烯合成的最后一步起作用.IAA含量降低将进一步通过IAA调节S—腺苷甲硫氨酸(SAM)转化成ACC这一过程,从而降低了乙烯形成。
Kevers等曾证明,对于玻璃苗,碱性过氧化酶同功酶活性增加,而酸性同功酶活性降低。
但总可溶性过氧化物酶活性增加,仅限于碱性提取物。
有人认为,玻璃化的形成主要是膜的效应而与核酸无关.乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展。
乙烯处理破坏了膜的结构,随着细胞壁解离,细胞内积累有在量纤维素及泡状物质。
可见,乙烯对玻璃化的影响,与改变组织的生理生化及纤维结构有关。
Hakkart F. A. 等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。
密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一(陈国菊等1992,李云等1996)。
(5)导致玻璃化的因素可能是培养基中高的含N量,特别是高的氨态N,。
(6) 还有人发现不同部位的节段外植体与玻璃化有关,以留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重,中部茎段次之,茎尖最好(柴明良);重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多,基部茎段较少,茎尖没有(郭达初)。
郭东红等(1989)认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关,茎尖外植体越小,出现玻璃苗比率越大。
玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程,碳、氮代谢和水分发生生理性异常所引起。
其实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度,植物只好用水分来充涨体积,从而表现玻璃化。
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1。
3。
2控制组培苗玻璃化的措施
尽管关于玻璃化的成因及其生理机制到目前为止仍未得出一致的结论,但对某些植物的玻璃化已得到有效的控制.这些研究表明,控制玻璃化要从培养的环境条件和生理生化方面入手,具体措施如下:
(1)利用固体培养,增加琼脂浓度,降低培养基的衬质势,造成细胞吸水阻遏。
提高琼脂纯度,也可降低玻璃化。
(2)适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂,降低培养基中的渗透势,减少培养基中植物材料可获得的水分,造成水分胁迫。
(3) 降低培养容器内部环境的相对湿度。
(4)适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度.
(5)控制温度适当低温处理,避免过高的培养温度在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好。
增加自然光照。
试验发现,玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红,玻璃化逐渐消失,因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟,加快木质化。
(6)增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量,降低N和Cl元素比例,特别降低铵态氮浓度,提高硝态氮含量。
(7)改善培养容器的通风换气条件,如用棉塞或通气好的封口膜封口。
(8)青霉素G钾(2mg/L-6mg/L)能有效防治菊花试管苗的玻璃化,青霉素(40万单位/升)可降低芥菜试管苗的玻璃化.
(9)培养基中加入间苯三酚或根皮苷。
1.4遗传稳定性
遗传稳定性即保持原有良种特性问题.虽然植物组织培养中可获得大量形态、生理特性不变的植株,但通过愈伤组织或悬浮培养诱导的苗木,经常会出现一些体细胞变异个体,虽然其中有些是有益变异但更多的是不良变异,诸如观赏植物不开花、花小或花色不正;果树植物不结果、抗性下降或果小、产量低、品质差等问题,在生产上造成很大损失,并容易引起经济纠纷,如香蕉试管苗中的不良变异表现植株矮小、不结果,给果农造成损失。
许多研究表明,在植物组织与细胞培养过程中,细胞、组织和再生植株以及后代中会出现各种变异这种变异具有普遍性,既不限于某些物种,也不局限于某些器官。
变异所涉及到的性状也相当广泛。
体细胞无性系变异的频率相当高,且不能逆转,有的高达40%~60%,如非洲堇的个别品种、玉簪等,有的高达100%,如马铃薯、菠萝等.
1。
4.1影响遗传稳定性的因素
(1)基因型:
基因型不同,发生变异的频率也不同。
在玉簪中,杂色叶培养的变异频率为43%,而且绿色叶仅为1。
2%。
甘蔗品系H37—1933和H50-7209中得到的再生植株分别有12。
1%和34。
8%变异香龙血树愈伤组织培养再生植株全部发生变异嵌合体植株通过组培,其嵌合性更大。
单倍体和多倍体变异大于二倍体。
(2)继代次数:
根据报道,试管苗的继代培养次数和时间影响植物稳定性,是造成变异的关键因素。
一般随继代次数和时间的增加,变异频率不断提高。
朱靖杰(1995)报道,北蕉诱导不定芽产生,其变异率继代5次为2。
14%;10次为4.2%;继代20次后则100%发生变异。
因而香蕉继代培养不能超过一年。
经长期继代培养的烟草愈伤组织再生植株,其花和叶的不正常性是很普遍的,而短期培养物却未发现变异研究表明,变异往往出现在由年龄渐老的培养物所再生的植株中,而由幼龄培养物再生的植株一般较少发生,也就是说,各种变异发生的频率随组织培养时间的增加而提高。
长期营养繁殖的植物变异率较高,有人认为这是由于在外植体的体细胞中已经积累着遗传变异.
(3)发生方式:
离体器官发生有5种类型,以茎尖、茎段等发生不定芽的方式繁殖不易发生变异或变异率极低.甘肃农业大学通过节培法繁殖名贵葡萄品种,经5~8年继代培养,其变异频率与常规方法相同,在数成株中仅发现一株变异此外用菊花茎尖、腋芽培养,变异较低,而从花瓣诱导的变异较高。
由花椰菜根诱导的不定芽和再生植株中有不少变异,而从顶端分生组织(花菜)产生的4000个再生植株基本没有变异。
通过愈伤组织和悬浮培养分化不定芽的方式获得再生植株变异率较高。
通过分化胚状途径再生植株变异较少,通过茎尖或分生组织培养增殖侧芽可以保持基因型基本不变。
在高浓度的激素作用下,细胞分裂和生长加快,不正常分裂频率增高,再生植株变异也增多。
1.4。
2提高遗传稳定性,减少变异的措施
在进行植物快速繁殖时,应尽量采用不易发生体细胞变异的增殖途径,以减少或避免植物个体或细胞发生变异,如采用生长点、腋芽生枝、胚状体繁殖方式,可有效地减少变异缩短继代时间,限制继代次数,每隔一定继代次数后,从新开始接外植体进行新的继代培养;取幼年的外植体材料;采用适当的生长调节物质种类和较低的浓度;减少或不使用培养基中容易引起诱变的化学物质;定期检测、及时剔除生理、形态异常苗,并进行多年跟踪检测,调查再生植株开花结实特性,以确定其生物学性状和经济性状是否稳定.
1。
5黄化问题
1.5。
1黄化原因
组培苗黄化是指在组织培养过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的幼苗整株失绿,全部或部分叶片黄化、斑驳的现象。
黄化现象在植物组织培养中比较常见,特别在部分木本花卉中较为常见,引起黄化的主要原因是培养基中Fe的含量不足;各矿质营养不均衡;培养环境通气不良,瓶内乙烯含量升高;激素配比不当;糖用量不足或长时间不转移糖已耗尽;PH值变化过大;培养温度不适;光照不足等。
1.5.2黄化解决的方法
在配制母液和培养基的制作过程中,要检查仪器设备是否准确,还要认真细致地核对每项称量的每一个环节;及时转接培养物;使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况;适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度;配制培养基时切记不要忘记加糖;控制培养室内的温度;适当增加光照;另外,在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等,有时也会出现幼苗黄化现象,应适当减少用量或停止使用。
2离体快繁的前景与探讨
2.1其优点:
离体快繁可快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物;解决无性繁殖的问题
2.2适应现状的需求
(1) 依靠自然条件在较短时间内繁殖稀有植物和经济价值较高的植物,受到地理环境和季节的限制,很难达到快速、高效的目的;特别对于在短时期内需要达到一定数量,才能创造应有价值的植物,时间就是效益,只有通过组织培养的方法才能满足这一要求。
用组织培养法繁殖植物,这是组织培养应用于生产的主要的和成效最大的实例。
首先是在兰花上的成功应用。
自Morel在1960年得到兰花组织培养苗后,很快应用于生产,形成了组织培养法繁殖兰花工业。
(2)由于组织培养法繁殖植物的明显特点是快速,每年可以数以百万倍速度繁殖,因此对一些繁殖系数低,不能用种子繁殖的特优植物品种的繁殖,尤为意义重大。
提高植物离体快繁的质量,使抗性加强,产量高,品质好,提高生产量,使其更广泛地应用.在植物大规模繁殖期间,应特别注意污染及褐化(木本植物)问题,污染率、褐化率过高会导致生产成本过高.
2.3存在问题
(1)组培中虽可获得大量形态和生理稳定不变的植株,但也经常会出现一些体细胞变异
的个体,大多是有益的变异,但更多的是不良变异.
(2)在植物大规模繁殖期间,应特别注意污染及褐化(主要是木本植物)问题,污染率、褐化率过高会导致生产成本过高。
参考文献
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[14]李浚明编译。
植物组织培养教程,北京:
北京农业大学出版社,2002
致谢
本次论文设计历经几个月的时间终于顺利完成。
其间最应该感谢的是我的指导老师陈老师,在设计毕业论文期间得到了陈老师的悉心指导。
在本论文的研究和写作中,给予了我无微不至的关怀和全面的指导。
在论文设计中,严格要求我,在专业知识上对我的帮助,使我少走
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