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黄酒发酵过程中高级醇的形成与控制
摘要
高级醇是影响黄酒风味的重要物质之一,本文通过同源重组技术分别对支链氨基酸转氨酶的编码基因BAT1和BAT2,以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶的编码基因HOM2进行敲除,研究这些基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。
主要研究内容及结果如下:
(1)构建重组质粒pUC-BABK,PCR扩增重组质粒pUC-BABK上的重组盒BA-KanMX-BB并将其转化黄酒酵母单倍体,筛选获得BAT1基因敲除突变株。
将BAT1基因敲除突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验,发酵结果显示BAT1基因敲除突变株的高级醇生成量和基本发酵性能均未发生明显变化。
(2)将重组盒BA-KanMX-BB转化BAT2基因敲除黄酒酵母单倍体突变株,筛选获得BAT1、BAT2基因双敲除突变株。
将BAT1、BAT2双敲除突变株及其单敲除突变株与出发菌株同时进行黄酒发酵实验,发酵结果显示:
BAT1、BAT2双敲除突变株的生长繁殖受到了抑制,CO2总失重平均降低了2.8g,酒精度平均下降了1.5度。
同时,BAT1、BAT2双敲除突变株产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量较出发菌株分别平均降低了10.46%、52.16%、25.31%,较BAT1突变株分别平均降低了10.12%、51.82%、25.28%,较BAT2突变株分别平均降低了10.76%、24.71%、15.72%。
(3)构建重组质粒pUC-HABK,PCR扩增重组质粒pUC-HABK上的重组盒HA-KanMX-HB并将其转化黄酒酵母二倍体,筛选获得HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1。
将突变株RY1-1与出发菌株RY1同时进行黄酒发酵实验,发酵结果显示:
RY1-1产异戊醇的含量明显下降,比RY1降低了30.39%,并且其基本发酵性能无明显变化。
RY1-1去除KanMX抗性基因后,得到的突变株RY1-2的高级醇生成量和基本发酵性能与RY1-1相比基本保持不变。
(4)构建重组质粒pUC-HB1A1K,在突变株RY1-2的基础上再次敲除HOM2基因,获得HOM2基因两个等位基因敲除的突变株RY1-3。
将突变株RY1-3与突变株RY1-2及出发菌株RY1同时进行黄酒发酵实验,发酵结果显示:
与RY1和RY1-2相比,RY1-3的CO2总失重平均降低了5.0g,酒精度平均下降了3.5度。
同时,RY1-3产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量较RY1分别降低63.27%、46.80%和66.98%,较RY1-2分别降低63.75%、42.09%和53.52%。
关键词:
黄酒酵母;支链氨基酸转氨酶编码基因;天冬氨酸β-半醛脱氢酶编码基因;同源重组;黄酒发酵;高级醇
ABSTRACT
Inthispaper,higheralcoholsasthemainbyproductsduringyellowwineyeastfermentationwerestudied.BAT1andBAT2genesencodingbranched-chainaminoacidtransaminase,HOM2geneencodingasparticβsemi-aldehydedehydrogenasewereknockedoutbythedoublehomologousrecombination,respectively.Thenwestudiedtheeffectofgenedeletiononthebasicfermentationperformancesandhigheralcoholsproduction.
(1)RecombinantplasmidpUC-BABKwereconstructed.ThedisruptioncassetteBA-KanMX-BBfromtherecombinantplasmidpUC-BABKwastransformedintoyellowwineyeasthaploidandtheBAT1deletionstrainsweresuccessfullyobtained.TheyellowricewinefermentationtestofBAT1deletionstrainsandparentalstrainsshowedthatthehigheralcoholsproductionandthebasicfermentationperformanceswerenotaffectedbythedeletionofBAT1gene.
(2)ThedisruptioncassetteBA-KanMX-BBwastransformedintoBAT2deletionstrainsandtheBAT1andBAT2doubledeletionstrainsweresuccessfullyobtained.TheyellowricewinefermentationtestofBAT1andBAT2singleanddoubledeletionsstrainsandparentalstrainsshowedthatdeletionofbothBAT1andBAT2resultedingrowthretardationanddiminishedhigheralcoholsproduction.ThetotallossofCO2decreasedbyanaverageof2.8g,andethanolproductiondecreasedbyanaverageof1.5degrees.Thecontentofpropanol,isobutylalcoholandisoamylalcoholproducedbyBAT1andBAT2doubledeletionstrainsdecreasedbyanaverageof10.46%,52.16%and25.31%comparedwithparentalstrains,decreased10.12%,51.82%and25.28%comparedwithBAT1deletionstrains,decreased10.76%,24.71%,15.72%comparedwithBAT2deletionstrains.
(3)RecombinantplasmidpUC-HABKwereconstructed.ThedisruptioncassetteHA-KanMX-HBfromtherecombinantplasmidpUC-HABKwastransformedintoyellowwineyeastdiploidandobtainedonealleleHOM2genedeletionstrainRY1-1.TheyellowricewinefermentationtestofmutantstrainRY1-1andparentalstrainRY1showedthatthecontentofisoamylalcoholproducedbyRY1-1decreased30.39%comparedwithRY1,andthebasicfermentationperformanceofRY1-1didnotchange.TheKanMXofRY1-1wasdeletedviaCre/Loxpsystem,thenthemutantstrainRY1-2wasobtained.ThebasicfermentationperformancesandthehigheralcoholsproductionofRY1-2remainedunchangedcomparedwithRY1-1.
(4)RecombinantplasmidpUC-HA1B1Kwereconstructed.ThedisruptioncassetteHA1-KanMX-HB1fromtherecombinantplasmidpUC-HA1B1KwastransformedintomutantstrainRY1-2andobtainedtwoalleleHOM2genedeletionstrainRY1-3.TheyellowricewinefermentationtestofmutantstrainRY1-3,RY1-2andparentalstrainRY1showedthattheonceagaindeletionofHOM2resultedinseveregrowthretardationanddiminishedhigheralcoholsproductiongreatly.ThetotallossofCO2producedbyRY1-3decreasedbyanaverageof5.0g,andethanolproductiondecreasedbyanaverageof3.5degrees.Thecontentofpropanol,isobutylalcoholandisoamylalcoholproducedbyRY1-3decreased63.27%,46.80%and66.98%comparedwithRY1,decreased63.75%,42.09%and53.52%comparedwithRY1-2.
Keywords:
Yellowwineyeast,branched-chainaminoacidtransaminaseencodinggenes(BAT1andBAT2),asparticβsemi-aldehydedehydrogenaseencodinggene(HOM2),homologousrecombination,yellowricewinefermentation,higheralcohols
1前言
1.1黄酒概述
黄酒是我国的民族特产,至今已经有6、7千年的历史,与啤酒、葡萄酒并称为世界上三大最古老的酿造酒[1]。
黄酒由于具有悠久的历史、丰富的营养、独特的风味、酒精度低等特点[2],所以受到广大人民群众的喜爱。
黄酒是以谷物为主要原料酿制成的粮食酒,它不同于白酒,黄酒是没有经过蒸馏的,酒精含量较低。
黄酒是一种高营养性的饮料酒,所以又被誉为“液体蛋糕”。
黄酒中富含的营养物质有氨基酸、糖、肽等,其中黄酒中的氨基酸不仅种类高达20种之多,而且其含量非常丰富,其中人体必需的8种氨基酸含量,居酿造酒之首。
黄酒中还含有丰富的人体所必需的微量元素、有机酸和各种维生素[3-4]。
黄酒除了直接饮用外,还可以入药,也可以入馔来去腥增香。
黄酒是传统的养生保健佳品,目前的初步研究已经表明,黄酒具有抗衰老、抗氧化、降胆固醇、降血压、参与机体的代谢活动和免疫调节等功效[5-6]。
黄酒是一种集饮用与保健为一体的酿造酒,是我国重点发展和扶植的饮料酒之一。
我国从实行改革开放的政策以来,黄酒行业的发展速度较快。
近年来,由于国家政策的支持、黄酒企业积极引导人们消费,从而黄酒行业的发展势头良好,且行业的整体规模也稳步扩大。
2006年至2010年,我国的黄酒产量由63.8万千升增加至134.1万千升,合计增长110%,年平均复合增长率为20%。
黄酒行业龙头骨干不断做大做强,发展迅速。
2012年全国黄酒行业实现主营业务收入134.32亿元,同比增长12.89%;利润总额为14.49亿元,同比增长7.33%;工业销售产值136.40亿元,同比增长18.42%。
2013年1-8月,全国规模以上的黄酒企业销售额同比增加8%,利润增加19%左右,较其他酒种相对稳定。
但是,目前仍存在着一些问题制约着黄酒行业的快速发展,如消费市场地域性限制没有突破导致市场拓展艰难、业内存在着无序竞争从而导致黄酒价值低估身价降低、传统观念影响从而导致创新能力不够以及过分强调传统的黄酒酿造技术从而导致黄酒生产效率难以提高等。
随着人们生活水平和物质文化的日益提高,消费者对黄酒产品的品质要求也在不断的提高和变化,包括黄酒的风味口感和营养价值等,特别是消费者随着对黄酒的认识越来越高,对形成其风味的微量成分也越来越重视。
传统的黄酒产品介绍与宣传已经开始制约着消费群体的进一步快速扩大,同时也制约着地域性市场的进一步拓展。
如何运用研究成果来不断改进黄酒的传统酿造工艺技术,如何利用现代科学技术向生产者和消费者客观科学的介绍黄酒的风味物质,以及进一步的改善黄酒的口感和风味,达到吸引更多的消费者等,已经成为黄酒行业发展中重点研究的当务之急。
1.2黄酒风味物质概述
黄酒独特的生产工艺赋予了其丰满、醇和、柔顺、圆润、浓郁、悠长的感觉,也赋予了其醇、香、柔、爽的独特风味[7]。
黄酒这种独特的风味特征,是众多风味物质综合反应的集中体现。
黄酒中的风味物质种类非常丰富,主要包括醇类、酸类、酯类、
醛类及羰基化合物等,其中酸类是黄酒中的重要呈味物质,而醇类、酯类和醛类则是黄酒香气的骨架成分,这些风味物质之间具有风味累加、相杀作用或风味协同作用,从而形成了黄酒特有的复合香[8-10]。
其中,高级醇和酯类是黄酒中最重要的两类风味物质,对促进黄酒酒体丰满、浓厚,并增加酒的协调性起着重要作用。
1.2.1高级醇对黄酒风味的影响
高级醇通常又被称为杂醇油,是指具有三个碳原子以上的一元醇类物质的总称。
黄酒中的高级醇主要有正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、活性戊醇、苯甲醇、β-苯乙醇等[11-12],其中含量最高的是异戊醇和异丁醇,其次是正丙醇和苯乙醇[13]。
高级醇是黄酒酿造过程中不可避免的重要副产物,是构成黄酒酒体的重要成分。
高级醇的种类和含量对黄酒的口感、品质有很大的影响,黄酒中所含有的主要高级醇及其风味特征见表1-1。
适宜的高级醇含量能给人以柔和、醇厚、圆润、丰满及协调的感觉。
所以黄酒中的高级醇含量不宜过低或过高:
若过低,酒味淡,酒体不丰满;若过高,不但造成酒体有不愉快的异杂味,还会有较强的致醉性,也就是人们俗称的“上头”[14-17]。
另外,高级醇含量过高对人体有毒害作用,其毒性会随着分子量的增大而加剧。
尤其是异戊醇含量过高时,由于造成人体神经系统充血,而使人产生恶心、呕吐、头疼等中毒症状。
黄酒中高级醇含量仅次于异戊醇的是异丁醇,异丁醇的毒性虽然比异戊醇的毒性小,但是异丁醇含量过多也会刺激人的眼、鼻。
对人体粘膜有刺激性作用的正丙醇对人体生理作用则和乙醇相近。
黄酒中高级醇含量过高对人体有毒害作用这一点已经引起了消费者和生产者的高度重视,而且目前的检测数据显示,在所有酿造酒中,黄酒中高级醇的含量是最高的[18],因此采取安全有效的解决措施,达到控制黄酒中的高级醇含量在适宜的范围内,对提高黄酒的品质和地位、以及进一步扩展黄酒市场具有重要意义。
表1-1黄酒中主要高级醇及其显味特征
Table1-1Mainhigheralcoholsinyellowricewineandtheircharacteristicsofflavor
高级醇
显味特征
正丙醇
刺激的酒精味,似醚臭,有苦味
正丁醇
较强的乙醇味和微弱的清香感
异丁醇
有微弱的戊醇味,有苦味感
异戊醇
杂醇油味,刺舌头,稍涩,有香蕉味
苯乙醇
似玫瑰香味,微带苦涩
1.2.2酯类对黄酒风味的影响
酯类物质是黄酒中又一重要的风味物质,对黄酒的风味和品质起着关键性的作用,通常具有很强的水果味或花香味。
黄酒中的酯类物质种类丰富,包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸异戊酯等,其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯,占酯类物质总量的85%以上[19]。
中低沸点酯类的含量是随着发酵过程的进行而不断增加的,而高级酯类则增加的非常少,高级酯大部分产生于黄酒陈酿过程中,其含量随着贮存时间而逐渐升高[7,20]。
黄酒中常见的酯类及其所呈现的风味特征见表1-2,由表可知,黄酒中常见酯类对黄酒风味有着正面的作用,所以可以通过适当的提高这些有着积极作用的酯类的含量,来进一步改善黄酒的品质。
表1-2黄酒中主要酯类及其显味特征
Table1-2Mainestersinyellowricewineandtheircharacteristicsofflavor
酯类
显味特征
乙酸乙酯
香蕉、苹果香,味辣带涩,味淡
乳酸乙酯
香气弱,味微苦,适量有浓厚感,多则带涩
辛酸乙酯
似梨香、菠萝香,苹果味带甜
己酸乙酯
似菠萝香,味甜爽口,大曲酒香,有愉快气味
乙酸异戊酯
梨香,香蕉油香,苹果味
琥珀酸二乙酯
微弱并令人愉快的香气
1.2.3其他类物质对黄酒风味的影响
黄酒中的酸是黄酒风味中重要的呈味物质,含酸量过低,味淡,酒体不协调;含酸量过高,会影响酒体的整体风味。
黄酒中一些不愉快的味感部分来自于脂肪酸,所以黄酒中脂肪酸的含量以少一点为好。
黄酒中的氨基酸含量丰富,赋予黄酒复杂的口感。
黄酒中含糖量的多少也能够影响黄酒的品质,黄酒中含有一定量的糖能够赋予酒体醇厚感和愉快感,而含糖量过低的酒,其口感往往会比较粗糙。
1.3黄酒发酵过程中高级醇的形成与控制
1.3.1高级醇的形成机理
研究表明,在酿酒过程的主发酵期间,酵母菌的生长繁殖伴随着高级醇的生成,80%的高级醇是在这段时间逐渐形成的[21],酵母生成高级醇的代谢途径有两个(图1-1):
一是分解代谢途径即Ehrlich途径,由氨基酸转氨途径生成α-酮酸[22-23],α-酮酸经脱羧再脱氢生成高级醇;二是糖代谢途径即Harris途径,由葡萄糖经过EMP途径以及TCA循环生成α-酮酸[24-25],α-酮酸经脱羧再脱氢生成高级醇。
在正常发酵液中生成的高级醇总量,75%是由糖代谢产生的,另外25%来源于Ehrlich途径[26-27]。
图1-1高级醇合成途径
Fig.1-1Synthesispathwayofhigheralcohols
1.3.1.1分解代谢途径(Ehrlich代谢机制)
1907年,德国化学家Ehrlich[28]最早提出了由氨基酸的分解代谢形成高级醇的途径。
1911年,Neubauer[29]等人对Ehrlich代谢途径进行了进一步的补充,即推断a-酮酸是高级醇代谢过程中重要的中间代谢产物,a-酮酸经脱羧转化成醛,醛再进一步还原为相应的高级醇。
随后,Lampitt[30],Yamada[31],Thorne[32-33],Ingraham[34]等进一步研究证实氨基酸的分解代谢生成各种高级醇。
Ehrlich代谢机制随着其后研究的不断完善,现在可归纳为:
酿酒酵母在酒精发酵过程中,氨基酸通过转氨酶的转氨作用将氨基转移到α-酮戊二酸上形成谷氨酸和α-酮酸,α-酮酸在脱羧酶催化作用下,经脱羧成醛,醛再经醇脱氢酶作用下还原为相应的高级醇,反应过程如图1-2所示[35-36]。
图1-2Ehrlich代谢途径
Fig.1-2Ehrlichpathway
根据此反应机制,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等都可以转化为相应的高级醇。
各种氨基酸与相应的高级醇之间的关系见表1-3。
表1-3氨基酸代谢产物与其相应的高级醇
Table1-3Aminoacidmetaboliteanditscorrespondinghigheralcohol
氨基酸
α-酮酸
高级醇
亮氨酸
α-异己酸
异戊醇
异亮氨酸
α-酮基-β-甲基戊酸
活性戊醇
缬氨酸
α-酮基异戊酸
异丁醇
苏氨酸
α-酮基丁酸
丙醇
苯丙氨酸
3-苯基-2-酮基丙酸
苯丙醇
1.3.1.2合成代谢途径(Harris途径)
经过进一步研究得知,氨基酸分解代谢途径并不是高级醇生成的唯一途径,主要依据可以归纳为以下几点:
(1)在合成培养基中进行酒精发酵时,培养基中加入的氨基酸种类与生成的高级醇种类不具有相关性;
(2)高级醇的生成速率与乙醇的形成速率相平行,与培养基中氨基酸含量的高低无关;(3)酵母在含有单一氮源的培养基中发酵时,仍能形成各种高级醇;(4)高级醇中的某些组成(如正丁醇,其相应的氨基酸为缬氨酸)在自然界中并不存在。
Harris于1953年提出了高级醇由糖代谢通过丙酮酸的合成途径[37]。
Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高级醇[38],即合成代谢途径:
糖类提供合成氨基酸的碳骨架,然后在合成代谢的最后阶段形成α-酮酸中间体,α-酮酸中间体经脱羧和还原形成相应的高级醇[39]。
Webb[40]和Ingraham[34,41-42]于1963年,共同提出了异丁醇的糖代谢合成途径。
此后的研究中,正丙醇、异戊醇和活性戊醇的合成代谢途径也陆续被提出并最终得到证明,总的反应途径如图1-3所示。
图1-3Harris途径
Fig.1-3Harrispathway
1.3.2影响黄酒中高级醇含量的主要因素
影响黄酒中高级醇含量的因素有很多,如原辅料的成分及比例、发酵工艺的控制、酵母菌种及黄酒后处理工艺等,这些因素相互作用,共同决定黄酒中的高级醇含量[43]。
1.3.2.1黄酒酿造原辅料
黄酒发酵过程中,原料及微生物中蛋白质的分解是氨基酸的主要来源。
原辅料中含有丰富的蛋白质,主要包括酿造用米和制曲用小麦等,这些物质为黄酒酿造提供了大量的蛋白质。
黄酒酿造过程中的微生物数量多且种类广,除了酵母菌,还包括细菌、霉菌等,这些微生物死亡后自溶于发酵醪液中,也会提供丰富的蛋白质[44]。
在整个黄酒酿造过程中,氨基酸的含量是一个动态过程,其原因主要为以下两个方面:
一是酵母菌等微生物的生长繁殖需要消耗氨基酸,二是在蛋白酶的作用下蛋白质可以不断水解为氨基酸。
由于发酵醪中存在过量的氨基酸时会通过分解代谢途径转化为高级醇,因此控制发酵醪中初始物的浓度可以有利于降低高级醇的生成量[38]。
1.3.2.2碳氮比
这里的氮源主要是指氨基酸态氮,在黄酒酿造过程中,当醪液中氨基酸含量较低时,不能满足酵母菌的生长繁殖需要,酵母菌就会通过Harris途径合成其所需要的氨基酸,这样就会形成较多的α-酮酸,并经过脱羧和还原形成高级醇;当醪液中氨基酸含量较高时,酵母的生长繁殖增加,从而也会导致生成的高级醇含量增加,而且某些特定的的氨基酸也可以通过Ehrlich代谢途径转化形成相应的高级醇[45]。
因此发酵醪中的碳氮比控制在能满足酵母菌的需要的范围内,这样能够防止生成过多的高级醇。
1.3.2.3酵母菌种同化氨基酸的能力
酵母菌吸收氨基酸的主要方式是主动运输,如果酵母分泌的运输酶不同,那其同化的氨基酸也就不同[46]。
酵母菌在黄酒发酵过程中,能快速同化的氨基酸只有8种,但是酵母菌生长繁殖过程中需要的不仅仅是这8中氨基酸,所以酵母菌只能依靠自身合成那些不能被自身同化的氨基酸。
酵母菌
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