人类体细胞染色体标本制备与核型分析.docx
- 文档编号:26579400
- 上传时间:2023-06-20
- 格式:DOCX
- 页数:51
- 大小:271.25KB
人类体细胞染色体标本制备与核型分析.docx
《人类体细胞染色体标本制备与核型分析.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人类体细胞染色体标本制备与核型分析.docx(51页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
人类体细胞染色体标本制备与核型分析
实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析
MetaphaseChromosomePreparationandAnalysisofKaryotype
【实验目的】
1•熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。
2.熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。
【实验原理】
染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。
因此,必须获得染色体标本才能进行检查分析,通常情况下,都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。
正常情况下,人体外周血淋巴细胞不再分裂,但植物血凝素
(PHA可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞,使其恢复增殖能力。
因此,可采取少量外周静脉血,做短期培养,培养至72小时细胞进入增殖旺盛期,此时加入秋水仙素抑制细胞分裂,使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞,经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。
上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后,可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹一一带,表明每条染色体的特征。
【实验用品】
1.采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。
2.RPMI1640液体培养基、小牛血清、肝素(500U/ml)、植物血凝素(PHA、秋水仙素(10mg/ml)、KCl低渗液(0.075mol/L)、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液(PH6.8)。
3.2.5%胰酶溶液(Hanks液配制)、0.4%酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。
【实验步骤】
一.外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析
1.采血及接种培养
1.1在酒精灯火焰上,用灭菌注射器(一次性注射器)抽取肝素0.2ml,
使肝素湿润至管壁。
1.2常规消毒后,采集外周静脉血5ml,转动注射器使血液与肝素混匀。
1.3在超净工作台中,预先将RPMI1640液体培养基(5ml,含植物血凝素60mg/ml、10%」、牛血清)加入消毒好的小培养瓶中,再滴加25滴全血(6号针头),水平摇动混匀。
1.4置37C恒温培养箱中培养72小时。
培养过程中每天水平摇动培养物1〜2次,使血液均匀悬浮,再继续培养。
1.5终止培养前2〜4小时,加入秋水仙素,使终浓度达到0.2卩g/ml。
轻轻摇动培养瓶,使秋水仙素混匀。
继续培养至72小时。
2.制片
2.1收集细胞时,去掉瓶塞,用乳头吸管吸取培养液,充分混匀培养物,再将全部培养物吸入刻度离心管中。
2.21000rpm离心8分钟(注意先配平)。
2.3弃上清液,加入37E预温的0.075mol/LKCl溶液8ml,用吸管轻轻吹打细胞团混匀后,置37C恒温水浴箱低渗处理25分钟。
2.4加入1ml新配制的固定剂(甲醇:
冰乙酸=3:
1),用吸管小心吹打、混匀,1000rpm离心8分钟。
2.5弃上清液,加入8ml固定剂,吹打细胞团制成细胞悬液后,室温下固定20分钟。
2.61000rpm离心8分钟。
2.7弃上清液,重复固定一次。
2.8弃上清液,根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂,吹打细胞制成悬液。
2.9吸取少量细胞悬液,滴2〜3滴于冰水浸泡过的载玻片上,吹散,气干。
2.10将标本置Giemsa染液中,染色8分钟,水洗去浮色,气干。
2.11显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。
.人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析
1.G显带染色体标本制备
1.1常规制片后,将标本置70C烤箱中干烤2小时,自然冷却。
1.2取2.5%胰酶溶液5ml,加入染色缸中,加入45ml生理盐水,用1NHCI或1NNaO阪酚红调节胰酶溶液成紫红色(PH6.8〜7.2),置37°C预温。
1.3将玻片标本放入胰酶溶液中处理25〜45秒钟,不断轻轻摇动玻片,使胰酶作用均匀。
随着处理标本数量增加,胰酶逐渐消耗,胰酶作用时间逐渐延长。
1.4取出染色体玻片标本,置于37C预温的生理盐水中,然后用蒸馏水冲洗玻片(或轻甩,除去多余的胰酶)。
1.5将玻片标本放入37E预温的Giemsa染液中,染色5〜10分钟。
1.6自来水冲洗,气干。
1.7显微镜观察。
【实验结果与分析】
:
常规染色体核型分析
1•根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置,将染色体分为七组。
A组染色体:
包括1〜3号染色体。
长度最长,1号和3号染色体为中央着丝粒,2号染色体为亚中央着丝粒染色体。
B组染色体:
包括4〜5号染色体,长度次于A组;亚中央着丝粒染色体,短臂较短。
C组染色体:
包括6〜12号和X染色体,中等长度,亚中央着丝粒染色体。
D组染色体:
包括13〜15号染色体,具有近端着丝粒和随体。
E组染色体:
包括16〜18号染色体,16号染色体着丝粒在3/8处,17号和18号染色体着丝粒约在1/4处。
F组染色体:
包括19号和20号染色体,中央着丝粒。
G组染色体:
包括21号、22号和Y染色体,是染色体组中最小的,为近端着丝粒的染色体。
21号和22号染色体具有随体。
2.绘图:
绘出在显微镜下观察到的染色体。
I)MII(III
j345
G带显示的正常人显带核型特征(见附图1.1、1.2、1.3)
A■组染色体:
包括1〜3号染色体。
长度最长,1号和3号染色体为中央着丝粒,2号染色体为亚中央着丝粒染色体。
1号染色体
短臂:
在320条带左右的分裂相上,近侧段有两条深带,第2条深带稍宽;在处理好的标本上,远侧段可显出34条浅染的深带。
此臂分为3个区,近侧的第1深带为2区1带,第2深带为3区1带。
长臂:
副缢痕紧贴着丝粒,染色深浅不一,其远侧为一宽的浅带,近
中段与远侧段各有两条深带,中段两条深带稍靠近,其中第2条染色较浓。
此臂分为四个区,副缢痕远侧的浅带为2区1带,中段第2深带为3区1带,远侧段第1深带为4区1带。
2号染色体
短臂可见四条深带,中段的两条深带较靠近。
此臂分为2个区,中段
两条深带之间的浅带为2区1带。
长臂:
有7条深带,第3和第4深带有时融合。
此臂分为3个区•第2和第3深带之间的浅带为2区1带,第4和第5深带之间的浅带为3区1带。
3号染色体
着丝粒区浓染
短臂:
在近侧段可见一条较宽的深带,远侧段可见两条深带,其中远侧的一条较窄,且着色较浅,这是区别3号染色体短臂的重要特征。
近侧段的深带可分为两条深带。
此臂分2个区,中段浅带为2区1带。
长臂:
一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。
在显带好的标本上,近侧段的深带可分为两条深带,远侧段的深带可分为三条深带。
此臂分为2个区,中段浅带为2区1带。
B■组染色体:
包括4〜5号染色体,长度次于A组;亚中央着丝粒染色体,短臂较短。
4号染色体
短臂:
可见两条深带,近侧深带染色较浅,短臂只有一个区。
长臂:
可见均匀分布的四条深带,在显带较好的标本上,远侧段的两条深带可各自再分为两条较宽的深带。
此臂分为3个区,近侧段第1
和第2深带之间的浅带为2区1带,远侧段的两条深带之间的浅带为3区1带。
5号染色体
短臂:
可见两条深带,其中远侧的深带宽而且色浓,短臂只有一个区。
长臂:
近侧段有两条深带,染色较浅,有时不明显;中段可见三条深带,染色较深,有时融合成一条宽的深带;远侧段可见二条深带,近末端的一条着色较浓。
此臂可分为3个区,中段第2深带为2区1带,中段深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为3区1带。
C组染色体:
包括6〜12号和X染色体,中等长度,亚中央着丝粒染色体。
6号染色体
短臂:
中段有一条明显而宽阔的浅带,其中近侧段和远侧段各有一条深带,近侧深带紧贴着丝粒;在显带较好的标本上,远侧段的深带又可分为两条深带。
此臂分为2个区,中段的明显而宽阔的浅带为2区1带。
长臂:
可见五条深带,其中近侧的一条紧贴着丝粒,远侧段末端的一条深带着色较浅。
此臂分为2个区,第2和第3深带之间的浅带为2区1带。
7号染色体
着丝粒浓染。
短臂:
有三条深带,中段深带着色较淡,有时不明显;远侧深带着色浓宽,状如”瓶盖”。
此臂分为2个区,远侧段的浅带为2区1带。
长臂:
有三条明显的深带,远侧近末端的一条深带着色较淡,第2和第3深带稍接近。
此臂分为3个区,近侧第1深带为2区二带,中段的第2深带为3区1带。
8号染色体
短臂:
有两条深带,中段有一条较明显的浅带,这是与10号染色体相
区分的主要特征。
此臂分为2个区,中段的浅带为2区1带。
长臂:
可见三条分界不明显的深带,远侧段的深带着色较浓。
此臂分为2个区,中段的深带为2区1带。
9号染色体
着丝粒浓染。
短臂:
近侧段和中段各有一条带,在显带较好的标本上,中段可见两条窄的深带,此臂分为2个区,中段的深带为2区1带。
长臂:
可见明显的两条深带,副缢痕一般不着色,在有些标本上显现出特有狭长的颈部区。
此臂分为3个区,近侧的一条深带为2区1带,远出的一条深带为3区二带。
10号染色体
着丝粒浓染。
短臂:
近出段和中段各有一条深带,在有些标本的中段可见两条深带,但与8号染色体短行比较,其深带的分界不够清晰。
此臀只有一个区。
长臂:
可见明显的三条带,近侧的深带较明显,远侧的两条深带较靠
近,这是与8号染色体相鉴别的主要特征。
此管分为2个区,近侧段的一条深带为2区1带。
11号染色体
短臂:
近中段可见两条靠的很近的较窄的深带•在显带较差的标本上,只能看见一条宽带。
此臂只有1个区。
长臂:
近侧有一条深带,紧贴着丝粒•远侧段可见一条明显的较宽的
深带,这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带,这是与12号染
色体相鉴别的一个明显特征;在显带较好的标本上,远侧段的深带可分为两条较窄的深带,两深带之间有一条很窄的浅带,一般极难辨认,但它是一个分区的界标,在有些标本上近末端处还可见一条窄的淡色的深带。
此臂分为2个区,上述远侧两条深带之间的浅带为2区1带。
12号染色体
短臂:
中段可见一条深带。
此臂只有1个区。
长臂:
近侧有一条深带,紧贴着丝粒;中段有一条宽的深带,这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带,但与11号染色体相比较这条浅带较窄,这是鉴别11号与12号染色体的一个主要特征;在显带好的标本上,中段较宽的深带可分为三条深带,其正中的一条着色较浓;在有些标本上,远侧段的近端还可见1〜2条染色较淡的深带。
此行分为2个区,中段正中的深带为2区1带。
X染色体
其长度介于7号和8号染色体之间。
短臂:
中段有一条明显的深带,如竹节状。
在有些标本上,远侧段还
可见一条窄的、着色淡的深带。
此臂分为2个区,中段的深带为2区1带。
长臂:
可见4〜5条深带,近中部的一条深带最明显。
此臂分为2个区,近中段的深带2区1带。
D■组染色体:
包括13〜15号染色体,具有近端着丝粒和随体。
13号染色体
着丝粒浓染。
长臂:
可见4条深带,第1和第4带较窄,染色较淡。
第2和第3深带较宽,染色较浓,此臂分为3个区,第2深带为2区1带,第3深
带为3区1带。
14号染色体
着丝粒浓染。
长臂:
近侧和远侧各有一条明显的深带,在处理好的标本上,中段尚可见一条较浅的深带。
此臂分为3个区,近侧深带为2区1带,远侧深带为3区1带。
15号染色体
着丝粒浓染。
长臂:
中段有一条明显的深带,染色较浓,有的标本上,近侧段可见l〜2条淡染的深带。
此臂分为2个区,中段深带为2区1带。
E组染色体:
包括16〜18号染色体,16号染色体着丝粒在3/8处,17号和18号染色体着丝粒约在1/4处。
16号染色体
短臂:
中段有一条深带,较好的标本上可见两条深带。
此臂只有1个
区。
长臂:
中段和远侧各有一条深带,有时远侧段的一条不明显,副缢痕着色浓。
此臂分为2个区,中段深带为2区1带。
17号染色体
短臂:
有一条深带,紧贴着丝粒。
此臂只有1个区。
长臂:
远侧段可见一条深带,这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。
此臂分为2个区,这条明显而宽的浅带为2区1带。
18号染色体
短臂:
有一条窄的深带。
此臂只有1个区。
长臂:
近侧和远侧各有一条明显的深带。
此臂分为2个区,两深带之
间的浅带为2区1带。
F组染色体:
包括19号和20号染色体,中央着丝粒。
19号染色体
着丝粒及周围为深带,其余为浅带。
短臂和长臂均只有1个区。
20号染色体
着丝粒区浓染。
短臂:
有一条明显的深带。
此臂只有1个区。
长臂:
在中段和远侧段可见1—2条染色较浅的深带,有时全为浅带此管只有1个区。
G组染色体:
包括21号、22号和Y染色体,是染色体组中最小的,具近端着丝粒的染色体。
21号和22号染色体具有随体。
21号染色体
着丝粒区着色浅。
与22号染色体相比较,其长度比22号短。
其长臂近侧有一明显而宽的深带。
此臂分为2个区,其深带为2区1带。
22号染色体
着丝粒区染色浓。
与21号染色体相比较,其长度比21号长;在长臂上可见两条深带,近侧的一条着色较浓而且紧贴着丝粒,近中段的一条着色浅,在有的标本上不显现。
此臂只有1个区。
Y染色体
长度变化较大,有时整个长臂被染色成深带。
在染色较好的标本上,可见两条深带。
此臂只有1个区。
图1.1G显带染色体核型
23
45
1Fi
It
20
15
图1.2
i£
IB
22
G显带染色体核型分析
15
1O
EXf
Si
12
mm
2122Y»
图1.3正常男性G显带染色体模式图
【注意的问题】
1.采血时不要加入太多的肝素,因为肝素含量过多时往往抑制淋巴细胞的转化。
2.培养过程中培养液逐渐变黄色,说明pH发生了较大变化,将不利于细胞生长,此时可加入适量灭菌的1.4%NaHCO容液调整,或再加入2〜3ml培养液的办法来校正。
3•培养失败的原因,一般有下述几种:
①培养瓶及器材洗涤不符合要求;②配制溶液的双蒸水不符合要求;③PHA和培养液的质量有问题,或培养液pH不符合要求;④无菌操作不符合要求,发生污染;⑤淋巴细胞对PHA反应
降低,致分裂相太少。
4.标本质量不佳的原因:
①秋水仙素的处理不当,如秋水仙素的浓度不够或处理时间不足,结果分裂相太少;如浓度过高或处理时间过长,则使染色体过于缩短,难于进行分析;②低渗处理不当,低渗处理时间过长时,细胞膜往往过早破裂,染色体丢失;如果低渗处理不够,则染色体分散不佳,难以进行计数分析;③离心速度不合适,收集细胞时离心的速度太低易丢失细胞,如果低渗后离心速度过高,往往使分裂相过早破裂,完整的分裂相减少;④标本固定不充分,如固定液不新鲜,或甲醇、冰醋酸的质量不佳,结果染色体模糊,或残留胞浆痕迹,使背景不清;⑤玻片去污不彻底,冷冻不
够,使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失,或染色体分散不佳。
5.制备G显带染色体标本时,要严格控制胰酶消化时间,时间不足显不出带纹,时间过长,使染色体不规则或形成空泡状。
附录
一、试剂及配制:
1、RPMI1640培养液
RPMI164010.4g
肝素
PHA
80mg
182mg
胎牛血清100ml
抗困素
8万单位
NaHCO32g
双蒸水定容至1000ml。
抽滤除菌,分装,-200C保存待用
2、低渗液(0.075MolKCI)
KCI2.794g
三蒸水500ml
3、固定液
甲醇(AR:
冰醋酸(AR=3:
1现用现配。
4、Giemsa染液
贮存液
Giemsa5g
纯甘油(AR330ml
甲醇(AR33ml
先将Giemsa粉剂溶于少量的甘油中,在研钵中充分研磨至无颗粒粘糊状,再将全部甘油加入,然后移至烧杯中,在55〜60匕温箱中放置2小时,冷却后加入甲醇,充分搅拌均匀,在室温放置2〜3周后过滤除去絮状物,储存在棕色瓶中,一般放置3周后使用效果更好。
使用液
磷酸缓冲液甲、乙各2.5ml,加45ml双蒸水,加Giemsa原液2.5ml。
5、2.5%胰蛋白酶原液
胰蛋白酶粉剂2.5g
生理盐水100ml
&秋水仙素(10mg/ml,使用液100卩g/ml)
秋水仙素1g
生理盐水100ml抽滤,4OC棕色瓶保存。
7、肝素(2500U/ml,使用浓度50U/ml)
肝素钠312.5mg
生理盐水100ml高压灭菌。
8、Hanks液(g/L)
NaCl
8.00
KCl
0.40
CaCl2
0.14
MgSC?
7HO0.:
NaHPO
0.06
KHPQ
0.06
NaHCO
0.35
二、记录和检查回报表
表1染色体病病例检查分析记录
送检材料:
检查目的:
送检时间:
医生
编号:
送检者:
院科
患者姓名:
性另U:
年龄:
临床检查摘要于临床初步诊断:
家系资料:
表2染色体检查记录
(记录内容:
显微镜号、标本号、座标、核型与异常特点)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
37
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
48
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
表3染色体畸变分析记录
玻片号
性别号
座标
核型
畸变染色体特点
照片编号
讨论:
分析结果:
分析者:
年月曰
表4核型分析
12345
AB
6789101112X
C
131415161718
DE
19202122Y
FG
表5核型分析检查回报单
姓名
性另U
年龄
送检材料
送检目的
时间
编号
送检者
院科医生
临床初步诊断
细胞遗传学检查结果
(1)X染色质检杳Y染色质检杳
(2)核型分析
(3)皮肤文理特征
(4)家系分析
诊断
检查者签字
年月日
实验二X和丫染色质标本的制作与观察
XandYChromatinPreparationandObservation
【实验目的】
熟悉X染色质和丫染色质的形态特征及其检查方法
【实验原理】
正常女性核型为46,XX在间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体,即X染色质,这是女性细胞中一条X染色体随机Lyon化失活形成的。
这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体,使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。
称为X染色体的剂量补偿(参考Lyon假说)。
正常男性核型为46,XY在男性间期细胞核中,可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点,就是丫染色质(丫小体),大小约0.25〜0.3卩m是丫染色体长臂特异性着色而形成。
人的性别是由X和丫染色体决定的。
需要对人的性别进行鉴定时,除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外,还可以通过细胞学方法,如检查期间体细胞(口腔上皮,皮肤,羊水和血细胞等)的核内染色质一一X和丫
染色质来鉴定。
【实验用品】
显微镜、荧光显微镜、乙醇(无水乙醇,95%,70%、50%),甲醇,冰醋酸,硫堇,1%结晶紫,1mol/LHCI。
二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻片、载片、15ml刻度离心管、牙签、吸水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、采血针、3%醋酸溶液、pH6-6.5缓冲液、0.5%盐酸阿的平染液。
(注:
硫堇染液(工作液),①干液(硫堇):
硫堇1g或2g溶于100mL50临醇中,溶解后过滤备用;②醋酸钠缓冲液:
醋酸钠•3H2O9.7g,巴比妥钠
14.7g,溶于500mL蒸馏水中;③0.1mol/L盐酸;按①:
②:
③=40:
28:
32比例配成混合液,调pH5.7±0.2,即得硫堇工作液。
)
【实验步骤】
、X染色质的制备和观察
(一)取材
1.让受检者用水漱洗口腔数次,以尽量除去口腔内细菌或其它杂物
2.用牙签钝头部或木质器具刮取口内侧面的口腔粘膜上皮,弃去第次刮到的细胞。
3.同一部位连续刮取数次,将刮取物涮入装有生理盐水的离心管内
(二)标本的制作
1•将细胞悬液的离心管进行离心(1500rpm)10分钟,去上清液,留下细胞团。
2.加入新配制的固定液(3份甲醇:
1份冰醋酸)8mL混匀呈悬液。
固定30分钟。
3.离心(同上),去上清液,留下细胞团。
4.加入数滴(根据细胞多少而增减)固定液,充分混匀呈悬液。
5•滴一滴悬液至预先置冰盒中的干净载玻片上,晾干。
每份样本制片3
—4张。
(三)染色
Klinger硫堇染色法
1•将玻片标本置入1mol/LHCl中,37C条件下水解20分钟。
2.用蒸馏水充分冲洗、晾干。
3.硫堇染液中染色约15分钟。
4.蒸馏水冲洗、晾干。
硫堇染色的优点是只有细胞核清晰着色,胞浆不着色,因此细胞核背景清晰,利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认。
结晶紫的染色法
1.固定后的玻片标本经过70%、50%酒精及蒸馏水(更换两次蒸馏水)各5分钟。
2.置入1%结晶紫溶液中染色5〜8分钟。
大量制片时可用0.5%结晶紫染液,染色10〜15分钟左右。
3.95%酒精中分化(快速地在酒精中沾5〜8次)。
4.继续在无水乙醇中分化,间歇地用显微镜检查,直至标本中核结构的微细部分都很清楚为止(一般约1分钟)。
5.置入二甲苯中。
更换2次二甲苯,每次3分钟,以使标本透明。
6.树胶圭寸片。
(四)观察
1.先在低倍镜(10倍镜)下观察,可见视野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。
选择清楚而分散的细胞,移至视野中央,再换高倍镜仔细观察。
口腔上皮细胞为多边形的扁平状,细胞中央有一被染成深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。
核周围均质部分为细胞质。
细胞的外表为一很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜。
2.40倍或油镜下检查100个“可计数细胞”,并计数具有X染色质的细胞数。
二、丫染色质的制片与观察
(一)制作标本
1.采血
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 人类 体细胞 染色体 标本 制备 核型 分析