基因工程的基本操作程序上课用.ppt
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基因工程的基本操作程序上课用.ppt
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基因工程培育抗虫棉的简要过程:
基因工程培育抗虫棉的简要过程:
提取提取提取提取棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)苏云金芽苏云金芽苏云金芽苏云金芽孢杆菌孢杆菌孢杆菌孢杆菌抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNADNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入普通棉花普通棉花普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n
(1)目的基因的获取目的基因的获取n
(2)n(3)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞n(4)目的基因的检测与鉴定)目的基因的检测与鉴定基因基因表达载体表达载体的构建的构建一、目的基因的获取一、目的基因的获取1、目的基因:
主要指的是编码蛋白质的、目的基因:
主要指的是编码蛋白质的结结构基因构基因,也可以是一些具有调控作用的因,也可以是一些具有调控作用的因子。
子。
2、获取方法:
、获取方法:
(1)从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因;
(2)利用利用PCR技术扩增目的基因;技术扩增目的基因;(3)通过)通过DNA合成仪用化学方法直接合成合成仪用化学方法直接合成
(一)从基因文库中获取目的基因
(一)从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库?
什么叫基因文库?
将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到片断,导入到受体菌的群体受体菌的群体中,中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。
因,称为基因文库。
基因文库基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(cDNA文库)文库)基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较补:
原核细胞的基因结构补:
原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点,并与其结合。
并与其结合。
转录开始后,转录开始后,RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动,分子移动,并以并以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。
转录完毕后,转录完毕后,RNARNA链释放出来,紧接着链释放出来,紧接着RNARNA聚合酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。
模板链上脱落下来。
不能转录为信使不能转录为信使RNARNA,不能不能编码蛋白质。
编码蛋白质。
:
能转录相应的信使:
能转录相应的信使RNARNA,能能编码蛋白质编码蛋白质编码编码区区非非编编码码区区原核原核细胞细胞的的基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核苷酸序列,在该序列中,苷酸序列,在该序列中,最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上游的游的RNARNA聚合酶结合位点。
聚合酶结合位点。
非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游启动子启动子终止子终止子补:
真核细胞的基因结构补:
真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子外显子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游内含子:
内含子:
外显子:
外显子:
真真核核细细胞胞的的基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子:
能编码蛋白质的序列子:
能编码蛋白质的序列内含子:
不能编码蛋白质的序列内含子:
不能编码蛋白质的序列:
有调控作用的核苷酸序列,:
有调控作用的核苷酸序列,包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA聚合酶结合位点。
聚合酶结合位点。
非非编码序列:
编码序列:
包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的___和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质,原核编码相同数目氨基酸的蛋白质,原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗?
细胞与真核细胞基因结构一样长吗?
连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因表达的计算基因表达的计算nn在真核生物中,对应的是在真核生物中,对应的是的碱的碱基数基数DNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译631氨基酸数氨基酸数碱基数碱基数基因中外显子基因中外显子基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文库类型文库类型文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库文库文库基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少基因多少基因多少物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以基因文库与基因库基因库是指某一生物群体中的全部基因。
基因文库与基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。
基因文库中包含着为数众多的克隆,建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。
基因组文库的构建模式图基因组文库的构建模式图通过对通过对受体菌受体菌的培养的培养而储存而储存基因基因2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法(11)鸟枪法鸟枪法(22)反转录法反转录法(33)根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法人人人人工工工工合合合合成成成成法法法法(真核生物真核生物真核生物真核生物)多用于原核生物多用于原核生物多用于原核生物多用于原核生物直接分离法直接分离法(11)鸟枪法:
)鸟枪法:
供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离(直接分离法直接分离法)以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNA为模板,为模板,再再反转录酶反转录酶的催化下反转录成互补的单链的催化下反转录成互补的单链DNA,然后在,然后在DNA聚合酶的作用下合成双链聚合酶的作用下合成双链DNA,即,即cDNA,从而获得所需的基因。
,从而获得所需的基因。
(22)反转录法反转录法(cDNAcDNA文库的构建方法文库的构建方法)(3)根据已知的氨基酸序列合成)根据已知的氨基酸序列合成DNA法法:
根据已知蛋白根据已知蛋白根据已知蛋白根据已知蛋白质的氨基酸序列,质的氨基酸序列,质的氨基酸序列,质的氨基酸序列,推测出相应的信使推测出相应的信使推测出相应的信使推测出相应的信使RNARNA序列,然后按序列,然后按序列,然后按序列,然后按照碱基互补配对原照碱基互补配对原照碱基互补配对原照碱基互补配对原则,推测出它的结则,推测出它的结则,推测出它的结则,推测出它的结构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序列,再通过化学方列,再通过化学方列,再通过化学方列,再通过化学方法,以单核苷酸为法,以单核苷酸为法,以单核苷酸为法,以单核苷酸为原料合成目的基因。
原料合成目的基因。
原料合成目的基因。
原料合成目的基因。
蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?
优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大,盲目,工作量大,盲目,分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦,操作过程麻烦,mRNAmRNA很不稳定,要很不稳定,要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因思考:
思考:
如何从基因文库中得到所需要的基因?
如何从基因文库中得到所需要的基因?
依据:
目的基因的有关信息。
依据:
目的基因的有关信息。
如:
根据基因的核苷酸序列;如:
根据基因的核苷酸序列;基因的功能;基因的功能;基因在染色体上的位置;基因在染色体上的位置;基因的转录产物基因的转录产物mRNA;基因翻译产物蛋白质等特性。
基因翻译产物蛋白质等特性。
注意:
注意:
u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因,中不是直接保管相应基因,而是而是保存受体菌保存受体菌,菌中含基因。
,菌中含基因。
(二)
(二)利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1234522557294时间(min)温度()PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束概念:
概念:
PCRPCR全称为全称为_,是一项,是一项在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。
的核酸合成技术。
前提条件:
前提条件:
_;原料:
原料:
_、__、_、_。
原理:
原理:
_方式:
以方式:
以_方式扩增,即方式扩增,即_(nn为扩增循为扩增循环的次数)环的次数)结果:
结果:
聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数22nn使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板模板DNADNAn过程:
过程:
变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性:
变性:
加热至加热至9095双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火:
退火:
冷却至冷却至5560部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸:
延伸:
加热至加热至7075以目的基因为以目的基因为模板,合成互补的模板,合成互补的新新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸过程:
过程:
aa、DNADNA变性(变性(90-9590-95):
双链):
双链DNADNA模板模板在热作用下,在热作用下,_断裂,形成断裂,形成_bb、退火(退火(复性复性55-6555-65):
系统温度降低,引):
系统温度降低,引物与物与DNADNA模板结合,形成局部模板结合,形成局部_。
cc、延伸(延伸
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- 基因工程 基本 操作 程序 上课