基因诊断课件.ppt
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基因诊断课件.ppt
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第16章基因诊断王慧莲概述概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系,基因的改变,或是疾病发生的原因,或是疾系,基因的改变,或是疾病发生的原因,或是疾病发生的结果,或是疾病发生时的伴随现象,而病发生的结果,或是疾病发生时的伴随现象,而这些现象的出现是有规律的。
因此,可以通过检这些现象的出现是有规律的。
因此,可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展,疗效和测基因的改变来反映疾病的发生和发展,疗效和预后预后基因诊断:
是以基因诊断:
是以DNADNA或或RNARNA为诊断材料,通过检查为诊断材料,通过检查基因的存在、缺陷或表达异常,对人体状态和疾基因的存在、缺陷或表达异常,对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。
病作出诊断的方法和过程。
基因诊断经历了三个基本发展阶段第一阶段:
世纪年代,以DNA分子杂交为基础,通过限制性片段长度多态性性(RFLP)分析进行第二阶段:
应用PCR技术第三阶段:
应用基因芯片技术第一节第一节基因诊断的基础技术基因诊断的基础技术一一.基因诊断中常用的几种技术基因诊断中常用的几种技术
(一)
(一)核酸杂交核酸杂交
(二)
(二)PCRPCR(三)三)DNADNA序列测定序列测定(四)(四)DNADNA芯片技术芯片技术
(一)核酸分子杂交技术
(1)
(1)方法方法:
以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析.
(2)2)几种不同形式的核酸分子杂交几种不同形式的核酸分子杂交a.Southern印迹(southernblot)杂交:
用于DNA的检测,可用于基因的限制性内切酶谱分析,基因突变分析等b.Northern印迹(Northernblot)杂交:
用于RNA的检测,能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析c.斑点杂交(dotblot):
既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏;但特异性低d.原位杂交(insituhybridization):
是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置,用于染色体疾病的诊断分类:
玻片原位杂交:
如中期的染色体和组织切片.膜上原位杂交:
将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)原位杂交的镜像图
(二)PCR技术在基因诊断中的应用()等位基因特异性寡聚核苷酸()等位基因特异性寡聚核苷酸(alleleallelespecificoligonnucleotide,ASO)specificoligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交:
探针斑点杂交:
PCR-ASOPCR-ASO该方法是该方法是诊断已知点的突变:
诊断已知点的突变:
需分别合成野生型和突变型探需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时,只需用针在基因诊断时,只需用PCRPCR扩增受检者目的扩增受检者目的DNADNA片段,再片段,再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况:
分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况:
PCR扩增产物与正常探针杂交,不与突变探针杂交-不存在这种突变;只与突变探针杂交-突变基因为纯合子;与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子;与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型()单链构象多态性()单链构象多态性(singlestrandsinglestrandconformationploymorphism,SSCP)conformationploymorphism,SSCP)分析分析是一种基于单链是一种基于单链DNADNA构象差别来检测点突变的方构象差别来检测点突变的方法法DNADNA变性形成单链,在中性条件下长度相同的单变性形成单链,在中性条件下长度相同的单链指链指DNA,DNA,如果碱基组成和如果碱基组成和(或或)排列顺序不同排列顺序不同,形成的形成的构象就不同构象就不同,这样就形成了单链构象多态性这样就形成了单链构象多态性.这些分子这些分子在非变性在非变性PAGEPAGE中电泳中表现出不同的迁移率中电泳中表现出不同的迁移率.SSCPSSCPSSCPSSCP特别适于分析小于特别适于分析小于特别适于分析小于特别适于分析小于400400400400bpbpbpbp的的的的PCRPCRPCRPCR产物。
据认为产物。
据认为产物。
据认为产物。
据认为SSCPSSCPSSCPSSCP可可可可以区分以区分以区分以区分1111bpbpbpbp的差异的差异的差异的差异PCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容,因此电泳后结果分析不能确定基因变异的内容,因此电泳后结果分析不能确定基因变异的内容,因此电泳后结果分析不能确定基因变异的内容,因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析,确定变异性质有差异后还需进行测序分析,确定变异性质有差异后还需进行测序分析,确定变异性质有差异后还需进行测序分析,确定变异性质(3)(3)(3)(3)限制性片段长度多态性(限制性片段长度多态性(限制性片段长度多态性(限制性片段长度多态性(restrictionfragmentrestrictionfragmentrestrictionfragmentrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPlengthpolymorphisms,RFLPlengthpolymorphisms,RFLPlengthpolymorphisms,RFLP)分析分析分析分析基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进行消化时,其电泳条带的数目和大小就会产生改变,根据这些改变可以判断出突变是否存在.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱(4)PCR+(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性,DNA开始解链,从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带优点:
可靠,检出单碱基突变率可达缺点:
富含高熔点GC区时,则难以检测出突变()用甲基化特异性()用甲基化特异性PCRPCR(methylation-methylation-specificPCR)specificPCR)进行分析进行分析在PCR扩增前,先用化学试剂(NaHSO3)处理模板DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶(C)转变成尿嘧啶(U),在PCR扩增时,U与引物中A配对;而CpG岛上甲基化的C不受影响,在扩增时仍与G配对,基于这种差异可以进行甲基化特异性PCR设计一对甲基化特异性引物(引物中甲基化特异性引物(引物中GG结合模板中结合模板中C);C);和非甲基化特异性引物(引物中和非甲基化特异性引物(引物中AA结合模板中结合模板中U),U),通过通过PCRPCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰的扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰的DNADNA序列和非甲基化等位基因序列序列和非甲基化等位基因序列用于一些疾病和肿瘤的基因诊断用于一些疾病和肿瘤的基因诊断(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR):
就是对靶核酸分子进行定量分析的技术.根据PCR扩增指数增长期原理,理论上扩增产物累积分子数N=No(1+E),其中E是指每次循环中参与复制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求出No.但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较多.na.通过测定PCR产物量方法:
对已知量的靶DNA进行系列稀释,比较待测样品和已知系列稀释样品的PCR产量,还可对未知量的靶DNA进行绝对定量.b.采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析:
方法:
将待测DNA标本进行倍数稀释,直至扩增不到靶基因的稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数的相对量,是一种半定量方法.c.采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析方法:
该方法是在一个试管内同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制DNA的用量、可扩增性和管间扩增效率的变化,通过比较两段序列PCR扩增产物电泳带的荧光强度,对靶序列进行定量分析d.采用竞争抑制法对靶核酸进行定量分析:
方法:
参照标准不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,与待测序列具有相同的引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,底物,引物分子.方法:
将竞争模板作系列稀释后加入恒量的样品DNA进行PCR扩增,通过分离和分析竞争模板和样品DNA的PCR产量,对样品DNA进行定量分析e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点.FQ-PCR技术的两种定量形式:
绝对定量:
一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量.如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:
稳定,准确.相对定量:
指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin,rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素.(三)DNA序列测序1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法用放射性同位素标记引物,用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸,产生长度不同的DNA片段,再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段,放射自显影读出结果。
自动测序法采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。
DNA测序测定是基因突变检测的最直接,最准确的方法,它不仅可确定突变的部位,还可确定突变的性质(四)DNA芯片技术DNADNA芯片(芯片(DNAchip)DNAchip)又称为基因芯片,又称为基因芯片,DNADNA微阵列微阵列(DNAmicroarray)DNAmicroarray)该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理:
首先将一系列预先设计好的核酸探针(oligosorcDNA)有序地,高密度地排列在玻璃,硅片或尼龙膜等固体支持物上,制成DNA微阵列。
用荧光标记待测样品(DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后,通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度,再用特定的软件对荧光信号进行综合分析,就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。
基因芯片按照用途分为:
表达芯片,诊断芯片,指纹图谱芯片,测序芯片,毒理芯片等。
该技术可用于新基因鉴定,突变检测,表达监控和遗传制图等。
第二节第二节对不同的疾病需要采用不同的基对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略因诊断策略一.通过致病基因的检测诊断疾病已经基本清楚基因突变与疾病发生之间的分子机制,相关的基因已被克隆,测序,并被定位在染色体上。
如:
一些与疾病有关的内源基因-癌基因,抑癌基因和血红蛋白基因突变型。
诊断方法:
根据突变的基因序列设计探针.二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病许多基因病,虽然它们的基因结构还没有阐明,但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上,这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。
原理:
同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记,在遗传过程中分离的几率很低,常常一起遗传,形成连锁。
可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析,了解另
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