流式细胞仪标准操作规程.docx
- 文档编号:27819494
- 上传时间:2023-07-05
- 格式:DOCX
- 页数:52
- 大小:1.68MB
流式细胞仪标准操作规程.docx
《流式细胞仪标准操作规程.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《流式细胞仪标准操作规程.docx(52页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
流式细胞仪标准操作规程
流式细胞仪标准操作规程
××医院检验科临床免疫室作业指导书文件编号:
××-JYK-MY-×××
版本:
生效日期:
共页第页
1.目的
建立规范标准的××型流式细胞仪操作程序确保流式细胞检测结果准确可靠
2.仪器名称及型号
××(品牌)××(型号)流式细胞仪。
3.应用范围
适用于免疫组经授权的检验技术人员。
4.仪器简介和测试原理
流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号,工作在测量区进行。
所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。
液流中央的单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角为2x的整个空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长相同。
散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。
未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射,因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。
经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变,其散射光信号当然不同于活细胞。
散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关,还跟散射角及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
因此流式细胞仪综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。
5.开展项目
包括:
常规免疫功能检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、免疫细胞分型、造血干细胞检
6.仪器环境要求
无尘、通风良好的环境,无直接日照。
温度:
18~25℃,温度的改变应该<2℃/h。
室内湿度:
30%~80%。
7.操作规程
7.1·设备每日开机程序:
开启稳压电源、变压器,打开流式细胞仪电源。
开启其他周边配备电源,如打印机,开启计算机。
确认鞘液筒有八分满,废液桶近似空的,桶盖是旋紧的;所有管线及管路装置连接通畅,无扭曲、折叠。
将气压阀方向调在加压位置,用手感觉鞘液桶在慢慢鼓起。
排除液流过滤器中的气泡。
等待机器预热5~10min后可开始实验。
7.2·设备质控程序
7.2.1试剂准备:
取试剂盒中的Unlabeled试剂,充分混匀,加一滴到装有1ml鞘液的试管中,混匀,标记为“Unlabeled”。
取“FITC、PE、PerCP、Unlabeled”试剂,充分混匀,各加一滴到第二支装有3ml鞘液的试管中,混匀,标记为“Mixed”。
7.2.2上机操作
7.2.2.1按电脑桌面的“Facscomp”进入质控程序。
在出现的“Signin”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息,计算机将保存这些信息;单击“Accept”。
在实验选项中,选择“Iyse/No-Wash(INW)”:
免洗程序。
7.2.2.2在“Calibritebeadslotids”中,根据每种颜色的Beads所对应的“LotIds”,输入编号,此编号在“Calibratebeads”试剂盒内,打开新买的试剂盒,里面有一张橙色胶纸,取出贴在试剂盒的背面,标题是“CalibratebeadsTM3BatchNO”,选择“FacsFlowSheath”下的编号(右侧的编号)。
APCLotID此栏不能空,即使是三色校正试剂)。
7.2.2.3在右侧的保存选项中文件会自动保存,路径“Facstation\BDfile\FacscompDDMMYY”,还可以单击“Location”改变文件保存路径。
7.2.2.4按“Run”开始上样,在仪器面板上按“RunHi”。
高速运行,速度不能低于400个细胞/秒,速度过低可在管中加一滴微球。
7.2.2.5上第一管后,按“Start’键,仪器自动调节PM,完成后窗口底部出现“PMTSetSuccessfully”,暂停5s后自动进入下一个调节窗口。
注意:
速度不能低于400个细胞/秒,速度过低可在管中加一滴微球。
7.2.2.6上第二管,单击“Start”键,仪器开始自动调节补偿并进行灵敏度测试。
7.2.2.7完成后仪器会给出提示,最后软件给出一个“Summaryreport”。
检查报告中的“Result”是否都“Pass”,如果有的没有“Pass”,检测原因。
①是否试剂过期;②两个试管中的液体和鞘液桶中的是否相同;③仪器做月维护,完成后再重新做Facscomp仪器质控。
7.2.2.8打印报告,退出“Facscomp”软件。
7.3·样本检测程序
7.3.1样本准备:
取TrucountTube,编号。
用反向加样法在Tube中加入50μl充分混匀的抗凝全血,注意血不要碰到试管底部的微球(Beads)。
取20μl荧光抗体加入到管中,注意:
不要碰到血。
涡旋混匀,室温避光放置15min。
取出加入450μl1×FACS溶血素,充分混匀,避光放置15min。
24h内上机用“Multitest”软件获取细胞进行检测,上机前应充分混匀
7.3.2上机操作:
执行“Facscalibur”开机程序,进入“Multitest”软件。
7.3.2.1在出现的“SignIn”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息,计算机将保存这些信息,单击“Accept”。
7.3.2.2进入“SetUp”窗口:
在“Datasource”对话框中选择“FromCytometer:
AcquisitionandAnalysis”,在“EntryLevelFileNamePrefix”中选择“Samplename”;在“AutomaticSavingOptions”中选择“Datafile”“LaboratoryReport”“PhysicianReport”,软件会自动生成一个文件,文件的默认路径“Facstation\BDfile\Multiset\DDMMYY文件夹;在“ViewReports”中选择“Until‘Next’Buttonpressed”。
7.3.2.3单击“Accept”,进入“Facscomp”窗口,单击“SkipFacscomp”。
进入“Testprefs”窗口,在“PhysicianReportChoices”中,这一项可以是全选,运行了一种试剂,会自动报告相应的结果。
在窗口的最下方点“LotIds”,跳出一窗口,点此窗口左侧的“Absolutecountbeads”,在此窗口右侧输入TrucountTube的批号和Beads总数(标在包装袋上),单击“Save”。
单击“Accept”。
7.3.2.4进入“Samples”窗口,在表格中输入相应的PatientName、ID、CaseNumber,在Panel中选择CD4/8/3Truc。
在窗口最上方的“Cytometer”的下拉菜单中,单击“InstrumentSetting”,在出现的新对话框中单击“Open”;打开此路径下Facstation\BDFile\InstrumentSetting\Calibur.LNW文件。
调用仪器各个参数的条件,选好后单击“Set”,“Done”。
7.3.2.5单击“Runtests”,上样,调整SSC电压和阈值后,单击“Acquire”。
获取完成后,可以人工调整各个门的大小,单击“Continue”;打印“PhysReport”。
继续下一个实验,或单击Quit”,“Don'tsave”,退出“Multitest”软件。
7.4·每日关机程序:
将样品支撑架置于旁位,用2m110%漂白剂(有效氯浓度0.5%)作样品,使外管吸入1~2ml。
将样品支撑架置于中位,以“HiRun”运行5~10min,使内管吸入约1ml。
将样品换成蒸馏水重复上述步骤。
注意:
最后要剩余约1ml蒸馏水浸泡进样针,防止结晶形成。
选择“StandBy”模式5min后可关掉主机。
退出所有应用软件,关闭电脑,关闭稳压器和变压器。
将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。
8.维护保养
8.1·每日维护:
实验结束后,请于关机前清洁加样针的外管和内管,防止加样针堵塞或有染料残留。
清洁方法同每日关机程序
8.2·每月维护:
流式细胞仪使用一段时间后,在鞘液管路、废液管路和流动池中会有残留的碎片、污染物等,因此,需要定期清洗管路,要求至少每个月做一次8.2.1在仪器减压后,取下鞘液筒,倒空。
如有必要,应清洗鞘液筒。
将鞘液滤器短路,使鞘液不流经滤器,直接沿鞘液管路进入流动池。
鞘液筒中倒入2L浓度为0.5%~1%稀释漂白剂(注意不能使用原浓度)。
上样管中加入4m浓度为0.5%~1%稀释漂白剂。
流速选择Hi档,Run运行20~30min。
鞘液筒用蒸馏水清洗干净,再加入蒸馏水2L。
取下有漂白剂的上样管,换上有4ml蒸馏水的上样管。
流速选择Hi档,Run运行20~30min。
鞘液筒中换成鞘液,重新安装好鞘液滤器管路。
8.2.2流动池Prime两遍,Prime结束后,仪器自动回复到“StandBy”状态。
上样管中加入蒸馏水,Run运行5min。
仪器进入“StandBy”状态,可以进行样本检测。
8.3·定期维护
8.3.1更换鞘液过滤器:
如果鞘液污染将会影响样品检测结果时,在技术支持指导下或参照用户手册的有关内容自行更换。
8.3.2空气滤网的清洁:
空气滤网位于鞘液筒上方,可以用吸尘器或水洗的办法清洁空气滤网需要定期检査,发现滤网脏了,就需要清洗了。
拉出抽屉后取下空气滤网。
清洁滤网,如果水洗处理,应等滤网完全干了以后,再进行安装。
装回滤网,将其慢慢推回原位。
安装时注意滤网的方向,气流由下往上通过。
9.校准
91·从国家医药行业标准YY/T0588-2005《流式细胞仪》的具体要求出发,本着校准的原则,对仪器特性中涉及量值要求的项目进行控制。
9.2·正常工作条件:
包含校正球差、色差、慧差、场曲等在校准前的准备工作中进行说明。
9.3·荧光灵敏度:
根据物镜不同的数值孔径和种类,在4~15mm。
规范做计量特性要求
9.4·荧光线性:
±0.02~±0.15mm规范做计量特性要求。
9.5·前向角散射光检测灵敏度:
<1μm出厂保证,目前设计均可达到,不列入。
9.6·仪器分辨率:
荧光3个通道分辨率规范做计量特性要求。
9.7·前向角和侧向角散射光分辨率:
可以将外周血中红细胞和血小板分开。
出厂保证,不直接影响测量,不列入。
9.8·倍体分析线性:
二倍体细胞周期分析时可分辨的荧光强度比值。
出厂保证,不直接影响测量,不列入。
9.9·表面标志物检测准确性:
CD3、CD4、CD8测量值在质控品给值范围内,规范做计量特性要求。
9.10·表面标志物检测重复性:
CD3、CD、CD8阳性百分比CV<10%规范做计量特性要求。
9.11·携带污染率:
<1%规范做计量特性要求。
912·仪器稳定性:
≤±10%规范做计量特性要求。
913·仪器功能:
数据采集分析功能、三色荧光分析能力、DNA分析功能、出厂保证、非计量特性,不列入。
9.14·外观完好、标识清晰、牢固等在校准前的准备工作中进行说明。
9.15·环境要求:
气候环境、机械环境在校准前的准备工作中进行说明
9.16·安全医用电气安全使用要求在校准前的准备工作中进行说明。
10.报警及处理
10.1·如果发出了一项警报,则“警报”按钮将闪烁。
当“警报”按钮闪烁时,有必要打开警报”窗口査看相应的警报。
警报窗口识别各种系统警报状态。
10.2·选择“警报”(总览按钮),显示警报窗口。
选择各条警报,查看具体说明和消除办法。
根据相应的消除办法,纠正各个警报状况。
如有问题,请拨打××(品牌)××(型号)流式细胞仪客服电话。
11.注意事项
11.1·开机前务必检査鞘液桶和废液桶。
鞘液桶下有电子秤,空桶重量为5.5kg,使用过程中注意鞘液桶不能空,防止气体进入液路系统。
11.2·液路中气泡会严重影响实验结果,开机后一定要排除气泡,包括鞘液桶上方管路排除气泡、仪器管路右侧管路排除气泡、进样针Prime2~3次。
加鞘液后要稍等2~3min再排气泡
11.3·样品上机前一定要过滤(300目细胞筛或35~55m尼龙筛网),以防样品中团块堵塞进样针。
11.4·数据采集完,及时导出Experiment或FSC文件,并及时从Diva软件中删除原来的数据。
11.5·实验结束后严格按照关机程序清洗管路。
11.6·实验数据拷贝:
复制所要拷贝的数据,在桌面上双击FTP文件夹,直接将数据粘贴在打开的文件夹中,文件即开始上传。
上传结束后,在512厅里面的电脑上用U盘或移动盘拷贝数据。
11.7·严禁使用U盘直接插到与流式仪连接的电脑拷贝数据。
(哈小琴)
流式细胞仪标准操作规程
××医院检验科临床免疫室作业指导书文件编号:
××-JYK-MY-×××
版本:
生效日期:
共页第页
1.目的
规范流式细胞仪操作和维护程序,正确使用设备,保证检验质量。
2.仪器名称及型号
设备A:
××(品牌)××(型号)流式细胞仪。
设备B:
××(品牌)××(型号)流式细胞仪。
设备C:
××(品牌)××(型号)流式细胞仪。
3.应用范围
用于免疫组经授权的检验技术人员。
4.仪器简介和测试原理
多色流式细胞仪一般安装有一根或多根激光器,采用鞘液聚焦原理,样本流经鞘液流体聚焦,形成单细胞液流依次通过流动室。
激光器射出的光斑聚焦在流动室的中心处,在激光照射区域,细胞上标记的荧光染料受到激光的激发,产生荧光信号。
收光系统有效收集被分析样本中单个细胞或粒子被激光照射时产生的前向散射光、侧向散射光和荧光信号。
根据细胞标记的荧光素不同,在不同波长的激光激发下产生相应荧光信号,经光电倍增管放大和不同规格波长的滤光片过滤之后将特定波长的光信号输入到光学探测器。
光学探测器将光学信号转换为电脉冲信号,再经过数字化转化被计算机储存分析,得到单个细胞的物理和生物学特征。
如前向散射光(FSC)反映细胞大小,侧向散射光(SSC)反映细胞内部复杂程度,荧光信号则反映标记各种细胞功能和相关抗原的表达。
部分流式细胞仪还可结合流量测定技术实现绝对值计数。
5.开展项目
包括:
常规免疫功能检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、免疫细胞分型、造血干细胞检测等。
6.工作环境
温度:
16~32℃。
湿度:
20%~80%。
电源要求:
220VAC,50Hz。
环境尘埃指数:
良好。
散热空间:
良好。
仪器主机与旁边的物体(例如:
墙体)至少间隔20cm以上。
设备周围应尽可能无尘、无机械振动、无污染、无大噪声源和电源干扰;远离强电磁场干扰源;不要靠近电刷型电机、闪烁荧光灯和经常开关的电接触性设备;避免强光直接照射;避免置于热源及风源前;选择一个通风良好的位置;具有良好的接地环境;不要将主机放置在斜面上;室内使用。
7.操作规程
7.1·设备A
7.1.1开机程序
7.1.1.1检査液流车上鞘液桶和内置清洗液桶是否需要补充,一般保持八九成满。
倒空废液桶,可加入400ml次氯酸钠原液。
所有盖子旋紧,保持管路连接无扭曲。
7.1.1.2打开液流车上电源开关。
7.1.1.3开启计算机登录Windows7操作系统、双击桌面“设备A”软件,选择用户名登录,点击“Connect”,仪器随之开启。
7.1.1.4打开电源箱门,依次检查:
Airfilter和Vacuumfilter必须干燥无水;WaterTrap液体不能超过1/3;VacuumTrap液体不超过1/4;SystemVacuun表应在-17~-30in,Hg;SystemPressure表在28~32PSI范围之间。
7.1.1.5预热10~15min,Status灯变绿,软件提示:
“AwaitingSample”,可以上样检测。
7.1.2光路和流路的检测程序
7.1.2.1打开合适的光路和流路检测方案,例如:
qcflowcheckbry.PRO。
7.1.2.2从冰箱取出Flow-Checkpro微球,在室温平衡后混匀,加0.5ml(10~15滴)于流式管中,上样检测。
7.1.2.3当仪器采集到5000个微球时,自动停止上样。
可自动记录质控图(Levey-Jennings图),如图9-0-1。
7.1.2.4记录FS及荧光FL1~FL10的HPCV值,一般要求<3%,是否与以前记录相符
7.1.2.5若某个参数HPCV>3%,请点击软件上“Prime”键,排除气泡干扰后重测,如果排除气泡还是无法达到标准,请选择“Cleanse.PNL”清洗机器后重测,若以上处理均未达标,请联系厂家工程师。
7.1.3检测程序
7.1.3.1打开已保存方案:
选择“File”→“Openprotocol”,找到指定路径打开方案,或者从“ResourceExplorer”栏中拖入所需方案。
7.1.3.2将所有实验管依次放入转盘中,点击“Inserttube”键在“AcquisitionManager”区插入新实验管,在“CarouselNO”中输入盘号,在“Location”中输入管号,在“SampleID”中输入样本名称,点击“开始”按钮进行上样,如图9-0-2。
7.1.3.4数据分析:
将鼠标移到图形的左下角,左键按下出现的“∑”符号,可在图形下方看到检测后的统计数值(如图9-0-3),亦可建立FlowPage或PanelReport报告页,打印报告。
7.1.4清洗程序
7.1.4.1日常清洗程序:
将Cleaning液或者漂白水与双蒸水1:
1稀释,放入流式管内,并准备3管2ml双蒸水,依次放入上样盘。
选择“Panel-Cleanse.PNL”,拖入“Acquisitionmanager”栏中,编辑盘号和位置后运行。
7.1.4.2(leans液清洗程序:
当执行完上述流程后,直接点选软件上的“Cleanse”按键此时机器会用Cleansetank中的清洗液冲洗整个管路3~5min。
待软件下方指示列出现Pressidlemodebuttontoinitialize”,清洗结束。
此时若按“初始化”键,机器会自动将清洗液排入废桶内,如不执行“Idle”程序,则清洗液在管路中浸泡过夜,当隔天再次启动机器时,机器会自动将清洗液排入废液桶内。
注意:
使用Cleaning液浸泡管路不可超过24h,否则会造成管路受损。
7.1.5关机程序
7.1.5.1日常关机程序:
执行清洗程序后,退出“设备A”软件,点击桌面上的“FCOFF”关闭流式主机;依次关闭计算机主机、打印机开关。
7.1.5.2长期关机:
执行完上述日常关机程序后,将鞘液盒和清洁液盒都换为双蒸水,关闭电源箱开关,切断所有电源。
7.2·设备B
7.2.1开机准备:
保证鞘液余量充足,如需要,请更换鞘液桶。
保证废液桶已清空,且已进行了必要的消毒。
保证鞘液、废液的管路无弯折,连接可靠。
保证仪器的电源插头安全插入电源插座。
保证计算机电缆与仪器连接就绪。
7.2.2开机程序
7.2.2.1仪器开机:
打开仪器背面电源开关,仪器正面指示灯变为绿色闪烁状态。
7.2.2.2操作软件登录:
开启电脑,双击电脑桌面上的“软件B”图标,输入用户名和密码登录,进入操作软件界面。
系统自动进行初始化、开机倒计时及温控。
初始化及温控过程结束后,弹出“开机完成”提示,单击“确定”,开机完成,即可进行正常测试。
7.2.3自动上样过程(以淋巴细胞亚群检测为例):
①单击“
”按钮新增样本;②输入样本编号;③单击“检验项目”框下拉列表,从中选择“T/B/NK-Auto”模板;④双击待测样本T试管的“位置”框,弹出样本盘意图,单击盘号两侧的左/右箭头按钮,切换到欲选择的盘号,单击孔位选择T试管在样本盘上的位置;⑤双击待测样本BNK试管的“位置”框,弹出样本盘示意图,单击孔位选择BNK试管在样本盘上的位置(样本下的所有试管的盘号自动保持一致,更换任何试管的盘号,该样本下其他试管会自动更改为与其一致的盘号);⑥在“样本”界面“样本信息”区中可录入样本及患者信息;将准备好的样本放入与工作单一致的样本盘及试管位,正确安装样本盘;⑦选中工作单列表中待测样本的起始试管T试管;⑧单击“仪器控制”中的“
”启动自动进样按钮,仪器自动从设定的起始位置处开始依次执行样本测定。
参见图9-0-4。
所有试管测定完成后,自动进样停止,仪器状态指示灯恢复为绿色长亮,此时可安全打开仓门,取出试管或卸下样本盘。
两管样本都测试完成后,软件自动分析测试结果,并可在报告预览中出具检测报告。
同时也可根据需要,调整图形中的设门位置,统计结果随之更新。
设备B检测报告参见图9-0-5。
7.2.4开放上样过程:
单击“
”按钮新增样本;输入样本编号;单击“检验项目”框下拉列表,从中选择“T/B/NK-Auto模板;在“样本”界面“样本信息”区中可录入样本及患者信息;将T试管混匀后置于试管托架上,单击“仪器控制”中的“
”启动测试;当T试管测试完成后,将T试管取下,将BNK试管混匀后置于试管托架上,单击“仪器控制”中的“
”启动测试;两管样本都测试完成后软件自动分析测试
结果,并可在报告预览中出具检测报告。
同时也可根据需要调整图形中的设门位置,统计结果随之更新。
7.2.5鞘液及废液处理
7.2.5.1更换鞘液,鞘液将用完时,仪器产生“请更换鞘液”提示;取一桶鞘液,打开桶的包装盖,将鞘液瓶盖组件插入后拧紧,并放置于试剂托架上的鞘液位置;单击提示信息中的“确定”,之后可以继续进行测试。
7.2.5.2清空废液,废液将满时,仪器产生“请清空废液”提示;取下废液瓶盖组件,将废液桶清空后,装回废液瓶盖组件,并放回试剂托架上的废液位置;单击提示信息中的“确定”,之后可以继续进行测试。
7.2.6关机程序
7.2.6.1单击软件界面上方快捷图标区“③(关机)”按钮,弹出“是否确定关机?
”提示,单击“是”。
7.2.6.2再按照提示信息,分别将装有清洗液(用蒸馏水10倍稀释)、蒸馏水的试管放置于指定位置,单击“确定”后,仪器自动执行关机程序7.2.6.3关机流程结束后,弹出“关机完成”提示,单击“确定”,再关闭仪器电源。
清空废液桶中的废液,并妥善处理废液。
关闭“设备B”软件窗口,再关闭电脑。
7.3·设备C
7.3.1开机程序
7.3.1.1开机前检查“设备C”主机和工作站、储液台和自动上样器(如果配置有)的电源线都连接良好。
观察鞘液瓶、冲洗液瓶和清洗液瓶中的液面情况高于容器容量的1/3高度;排空废液容器,并向废液容器中加入50ml的专用清洗液。
7.3.1.2打开电源轻按“设备C”仪器面板上的电源按钮通电。
此时电源按钮灯显示为绿色,仪器自动对液体管路进行清洗。
7.3.1.3启动工作站,开启工作站和显示器,双击桌面图标运行“设备C”操作程序,选择用户名登录。
7.3.2检测程序:
仪器提供部分项目的预设检测方案模板,可直接选择相应测试,仪器自动完成分析和报告。
7.3.2.1方案设置:
点击“文件”-“新建”按钮,点击“从模板新建”,根据名称选择所需的自动项目模版。
如淋巴细胞亚群(4color-T/B/NK)模板,见图9-0-6。
7.3.2.2样本采集:
以“淋巴细胞亚群(4color-T/B/NK模板”为例,在“实验管理”面板,左键双击标本1节点下面的空白管,箭头所指表示即将要采集检测的样本,见图9-0-7。
充分混匀各管样本,进行样本采集。
7.3.2.3数据分析及保存:
检查各个样本,微调淋巴细胞门,十字门以及其他各门的位置以适应于淋巴细胞群以及各群圈门,关注Time-Count图显示气泡影响,如图9-0-8。
检查绝对计数设置是否正确:
菜单栏“样本”→“绝对计数设置”,如图90-9。
全部样本检查分析、设置无误后,点击“保存按钮保存数据。
7.3.2.4报告检查及打印:
点击每个标本节点下的“报告”按钮(图9
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞 标准 操作规程