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标准曲线思考
关于标准曲线相关问题的思考
1.响应曲线
1.1为了说明问题方便,首先定义一下响应曲线。
响应曲线是以响应值为横坐标(x),产生此响应值的相关物质浓度为纵坐标(y)的各点的平滑连线。
1.2响应曲线的特征
由于浓度数值不可以为负数,即y>=0;又因为响应值一般都为正数,所以响应曲线是位于第一象限内的一条曲线;
根据朗伯比尔吸收定律和和色谱检测原理,随着浓度的增加响应值也会随之增加,是一种正向相关,而且无论浓度增加为多大,所产生的响应值都不会低于浓度比其低产生的响应值。
所以,响应曲线应该是单调的、与浓度呈正相关的、无拐点的一条曲线。
由此可以得出相关曲线的两种基本形态。
凹型凸型
在色谱分析领域由于检测器的限制,实际上得到的相应曲线,只能是“凸型”的,下面只讨论这种形态的相应曲线。
这种凸型曲线,用数学表述的特点是,一阶导数大于0,二阶导数小于0
。
对于这点的感性理解就是,凸型曲线的代表的函数是增函数,斜率在初始点最大之后依次递减,直到斜率无限接近0。
(类似于加速度越来越小的加速运动)
在色谱领域可以理解成,响应值的随着浓度的增加而增加,在降低的浓度范围内近似成正比例(实际上,严格说不是呈正比例关系),但是随着浓度进一步提高会出现“响应值的变化慢于浓度的变化”。
也就是,经常说的超出线性范围。
2.朗伯-比尔定律的实质
2.1朗伯-比尔定律
比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。
在色谱领域就是:
在相同条件下,在一定的浓度范围内,响应值与产生该响应值的物质浓度成正比,抑或可以说成响应值之比等于浓度之比(两种实际上是有些差别的,其差别在于标准曲线的截距)。
这条定律适用的条件是:
a.入射光为平行单色光且垂直照射;b.吸光物质为均匀非散射体系;c.吸光质点之间无相互作用;d.辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程,无荧光和光化学现象发生。
(以上4点选自维基百科)。
对上述的要求逐点分析:
第1点应该是仪器设计的问题,没有讨论必要;第4点是说明北侧物质不能是被检测光源作用或者催化,通俗说就是不能发生见光分解等类似情况。
这点也好理解。
关键是第2、3点,它们都是要求被测样品不能浓度太高。
2.2永远的曲线
根据1中分析,应该得出响应曲线是一条“纯粹曲线”(或者成为“永远曲线”),任何一段看似直线的部分,只要将其间浓度点再细分,仍然得到的是一条曲线而不是直线。
也就是说如果你能够把曲线的x坐标无限细分,你将会看到的是一条“永远曲线”。
2.3比尔、朗伯错了吗
既然响应曲线是永远的曲线,那么比尔和朗伯却说在一定浓度范围内,响应值和浓度可以呈现一条直线,难道是它们搞错了吗?
我认为这是它们高明的地方,他们将响应曲线在低浓度的区域拟合了一条直线,并且以此为理论基础的实际应用科学在各个方面遍地开花。
响应曲线实际上是一条理想的曲线,只能存在与数学领域里面和人的头脑里面。
在实际工作中是得不到这样的曲线。
因为在实际工作中,仪器的精度不可能无限高,稀释也不可能无限小和毫无误差。
基于此在一定浓度范围内,三个或者三个以上的点是可以作出一条完美的直线的,因为他们之间的很小的差别被仪器的精确度限制住了。
2.4浓度对比尔-朗伯定律的影响
浓度对比尔-朗伯定律的影响,主要有以下两个方面。
一是浓度越高对光的散射越大;二是浓度越高分子之间的作用越强,而且越难形成均一的溶液。
两者严重影响此定律的成立。
3.标准曲线
标准曲线法的基础就是比尔-朗伯定律。
制备标准曲线必须要满足比尔-朗伯定律的要求,才会得到能够采信的标准曲线。
即要采用合适的低浓度,不是越低越好。
3.1制备标准曲线合适的浓度范围
制备标准曲线应该在适合的浓度范围内,过高和过低都不好。
浓度过低有两个不利因素:
1)由于仪器的分别率、信噪比的限制浓度过低检测准确性和重现性收到影响;
2)浓度越低越难取得满意的r^2值,还会使截距过大(见下图)。
以下是“凸型”曲线的数据和以此数据制备的标准曲线对比。
浓度
0
5
10
15
20
25
响应值
0
463.6476
785.3982
982.7937
1107.149
1190.29
浓度
30
35
40
45
50
55
响应值
1249.05
1292.497
1325.818
1352.127
1373.401
1390.943
0、5、10和15所做的标准曲线
40、45、50和55所做的标准曲线
3.2理论上截距不可能为负值
响应曲线是“凸型”曲线,由“凸型”曲线上任意两点组成的直线,的截距都是非负的。
如果是依次等间距取点的话,浓度越大其截距值越大。
标准曲线是相应曲线上的点,因此标准曲线的截距不可能为负值,其取值范围是[0,A
max)。
Amax为响应曲线上响应值。
但是在实际操作中由于各方面实验误差,会导致实验得到的响应值偏离理论上相应曲线,所以会导致负截距的出现。
3.3标准曲线法和单点校正法的比较
在色谱检测计算结果时候有两种计算方式,标准曲线法和单点校正法(实际上是包括原点在内的两点校正曲线)。
两种方法优势和劣势比较:
标准曲线相对于单点校正稍显麻烦,范围较宽适用的浓度范围较大,适合于常规的对于精度要求不高的检测;单点法检测准确性要高一些,但是能够满足高精确范围很小(一般样品响应值控制在标品响应值的80~120%范围内)。
3.4标准曲线法和单点校正法的优化
标准曲线法实际上扩大了检测范围而牺牲了检测精度,而单点法(80~120%)提高了检测精度而减小了,可信范围。
本人有一种思路可以尽量做到“扬长避短”,具体讲,如果100ul以下的标准曲线,可以采用以下个点做标准曲线,100,66.7,45,30,20等(制法简单做2/3稀释就可以了),这样的浓度间距设计可以保证每个期间的浓度,都有一个和此浓度最为接近的标品浓度而且其浓度必然在其最近标品浓度的80~120%之间。
在计算上分两步,1)找到根据样品的响应值找到其最近的标品点,2)根据包含样品的两个标品点做线性方程(就是两点的标准曲线);3)将样品响应值带入此线性方程,得出计算结果。
可能这样的做法对于手工计算非常麻烦,但是对于计算机软件是非常容易的。
此软件已经初步写完,在调试阶段。
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