蛋白质组学刘福.docx
- 文档编号:28572488
- 上传时间:2023-07-19
- 格式:DOCX
- 页数:29
- 大小:42.24KB
蛋白质组学刘福.docx
《蛋白质组学刘福.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蛋白质组学刘福.docx(29页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
蛋白质组学刘福
蛋白质组学结课报告
一、蛋白质组形式进行蛋白分离、提取的方法
(一)去垢剂沉淀法
原理:
去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多。
A.中性去垢剂又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用。
一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200;多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘类和吐温类;聚氧乙烯脂肪醇醚,如苄泽类、平平加类;聚氧乙烯烷基苯酚醚,如IgepalCO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。
中性去垢剂作用后可通过SephadexLH-50柱除去;也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂。
B.阴离子去垢剂常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。
前者可促进核蛋白的溶解,将核酸释放出来,并对核酸酶有一定抑制作用,常用于核酸的提取。
C.阳离子去垢剂如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净(TMPB)、杜灭芬等,消毒灭菌类居多。
D.天然表面活性剂又称为生物表面活性剂,包括种类较为广泛,如各种树胶(阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶)、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类(如环糊精)等。
E.两性表面活性剂在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质,起泡性好,去污力也强;在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征,其杀菌性很强。
实验方法步骤:
分离细胞膜蛋白的中应用
1、细胞放在冰上,去除上清,用pH7。
4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次 2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min 3、刮下单层细胞,4度下10 000g 5min离心
4、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相,然后37度下2 000g离心5min 5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀,冰浴2min后加温,在按步骤6再次离心 。
7、按步骤8再次抽提去污剂相,用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积 8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相,并进行免疫沉淀实验
(二)变性剂沉淀法
原理:
蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键,如氢键、盐键和疏水力,引起天然构象的解体;它们并不破坏共价键,如肽键和二硫键,故不涉及一级结构的改变。
变性剂有溶解型和沉淀型两类,SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂,而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。
一般而言,变性剂应用时常大大过量,破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克分子数,如1克蛋白质可可结合1.4g。
SDS溶于水可达25%,对温度敏感,W/V贮存液最为方便。
需要注意的是SDS的钾盐是不溶性的,所以SDS溶液中要避免混入钾盐。
尿素极易溶于水,可达10mol/L,在8mol/L以上要注意温度以防止沉淀。
尿素在水中缓慢分解形成氨及高度活性的氰酸离子,故要防止高温。
三氯乙酸与过氯酸(TCA,PCA)都是极好的沉淀剂,能沉淀蛋白质和核酸,前者应用更为广泛。
方法步骤:
尿素和盐酸胍在高浓度(4~8 mol/L)水溶液时能断裂氢键,从而使蛋白质发生不同程度的变性。
同事,还可以通过增大疏水基酸性残基在水相中的溶解度,降低疏水相互作用。
在室温下4~6 mol/L尿素和3~4 mol/L盐酸胍,可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点,通常增加变性剂浓度可提高变性程度,通常8 mol/L尿素的变性能力强。
一些球状蛋白质,甚至在8 mol/L尿素溶液中也不能完全变性,然而在8 mol/L盐酸胍溶液中,他们一般以无规则卷曲(完全变性)构象状态存在。
(三)等电点沉淀
原理:
蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。
因此在其他条件相同时,他的溶解度达到最低点。
在等电点之上或者之下时,蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥,阻止了单个分子聚集成沉淀,因此溶解度较大。
不同蛋白质具有不同的等电点,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理,可以把蛋白质混合物分开。
当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来,那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。
这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象,能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
方法步骤:
酪蛋白的提取
①去新鲜牛乳10ml放入50ml烧杯中,水浴加热至 40℃;
②向加热至40℃的新鲜牛乳中加入10ml加热至相同温度的0.2mol/ml醋酸—醋酸钠缓冲液,摇匀,用pH计测混合液的pH值,调节至4.8(用1%NaOH溶液或10%醋酸调整);
③、将混合液静置,冷却至室温,继续放置5分钟用细纱布过滤;
④、过滤所得沉淀物用少量蒸馏水洗几次,过滤;
⑤、过滤所得沉淀物即为粗酪蛋白。
(四)盐析与盐溶
原理:
低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。
球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出,这就是因为透析除去了盐类离子,使蛋白质分子之间的相互吸引增加,引起蛋白质分子的凝集并沉淀。
当溶液的离子强度增加到一定程度时,蛋白质溶解程度开始下降。
当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。
盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。
此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。
蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象,能再溶解。
盐析的中性盐以硫酸铵为最佳,在水中的溶解度很高,而溶解度的温度系数较低。
方法步骤:
取正常人混合血清加等量生理盐水,于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50%饱和(NH4)2SO4],4℃,3小时以上,使其充分沉淀离心(3000rpm),20分钟,弃上清,以生理盐水溶解沉淀至Xml。
再逐滴加饱和硫酸铵X/2ml,置4℃,3小时以上[此时(NH4)2SO4的饱和度为33%)],重复上述第二步过程1次。
将末次离心后所得沉淀物以0.02M,PH7.4PBS溶解至Xml装入透析袋。
对PBS充分透析、除盐换液3次,至萘氏试剂测透析外液为无黄色将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后,以751-G紫外分光光计测蛋白含量。
(五)有机溶剂分级分离法
原理:
与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。
在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性,如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下,然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂,以防局部浓度过高,那么变性可以得到很大程度缓解。
蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。
在一定温度、pH和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。
有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。
介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。
蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。
蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。
方法步骤:
改良丙酮沉淀法提取叶蛋白
取0.3g 左右的植物叶片,用液氮研磨,色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP,并将充分研磨过的样品转入离心管中,加入4mL 的提取缓冲液,摇匀并放在4℃条件下提取1h,充分溶解蛋白。
放置后的样品充分摇匀,4℃10000r/min 离心30min,弃沉淀,上清液中加入2.5~3倍体积的村-20℃条件下过夜,让蛋白充分沉淀。
之后,4℃10000r/min 离心30min,其上清,沉淀置于-20℃下,使丙酮完全挥发,如有必要加入上样缓冲液溶解沉淀。
缓冲液用量300ul,沉淀充分溶解后,转移至1.5mL 离心管中,4℃12000r/min 离心15min ,取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
(六)低温沉淀法。
原理:
蛋白质溶解度的影响:
在一定温度范围内,约0~40℃之间,大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加,在40~50℃以上,大部分蛋白质变得不稳定并开始变性,一般在中性pH介质中即失去溶解力。
大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。
方法步骤:
量取血清体积100mL,搅拌降温至0~4℃,将血清调pH 7.2,调节NaCl浓度至0.14 mol/L,加乙醇至8%,加入乙醇的时间控制在60~90min;从加乙醇开始起为反应体系降温,保持反应温度在-2~-4℃;加完乙醇后取样测pH值,调节pH值为7.2;继续搅拌1 h,静置30 min;3000 r/min离心10 min,去除上清,收集沉淀并称取质量。
(七)透析法
原理:
是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜,而大分子物质不能通过半透膜的性质,达到分离的方法。
例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时,可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。
反之也可将大分子的杂质留在半透膜内,而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中,而加以分离精制:
透析是否成功与透析膜的规格关系极大。
透析膜的膜孔有大有小,要根据欲分离成分的具体情况而选择。
透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜(硫酸纸膜)、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。
油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状,外面用尼龙网袋加以保护,小心加入欲透析的样品溶液,悬挂在清水容器中。
经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大,必要时适当加热,并加以搅拌,以利透析速度加快。
为了加快透析速度,还可应用电透析法,即在半在半透膜旁边纯溶剂两端放置二个电极,接通电路,则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动,而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动,中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中。
透析是否完全,须取透析膜内溶液进行定性反应检查。
蛋白质用盐析法沉淀分离后,需脱盐才能获得纯品,脱盐常用的方法为透析法.蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大,不能透过半透膜,而无机盐及其他低分子物质可以透过,故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯,即把蛋白质溶液装入透析袋内,透析袋可用玻璃纸、火棉胶、动物膜、羊皮纸等制成,将袋口用线扎紧,然后把它放进蒸馏水或缓冲液中进行透析,这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中,蛋白质分子量大,不能透过透析袋而被保留在袋内,通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液,直至袋内盐分透析完为止。
方法步骤:
(1)透析器的制备:
取5%火棉胶溶液5ml,放入洁净而干燥的小三角瓶中,徐徐转动,使其干化,用指甲或小刀刮开瓶口的薄膜,轻轻拉开,再用自来水将薄膜与瓶塞渐渐冲开即可作为本实验所用的透析袋,将其保存在水中,用时取出;
(2)注入含鸡蛋清氯化钠蛋白溶液5ml于上述自制透析袋中,将袋的开口端用线扎紧,然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中,使其上开口端位于水面之上。
经过20分钟后,自烧杯中取出水样1ml于试管中,加1%硝酸银溶液一滴,如有白色氯化银沉淀生成,即证明蒸馏水中已有Cl–存在,再自烧杯中取出水1ml于另一试管中进行双缩脲反应,加入10%氢氧化钠溶液2ml,摇匀,再加入1%硫酸铜溶液两滴,随加随摇。
观察是否有紫玫瑰色出现。
(3)每隔20分钟更换蒸馏水一次,经过数小时则可观察到火棉胶袋内出现轻微混浊,此即为蛋白沉淀。
(八)超滤法
原理:
超滤技术是一种以超滤膜作为分离介质,以膜两侧的压力差为驱动力,利用料液中各组分在高分子膜中传质的差异,对其进行分离、分级、纯化和浓缩的方法。
在超滤过程中,所用超滤膜的孔径约为1~100nm,截留相对分子质量(molecularweightcutoff,MWCO)为3×105~1×106,能用于蛋白质、细菌、胶体、病毒、热原、多糖等的分离滤技术的核心部件是超滤膜,其结构及所用材料性质对膜的分离性能起着决定性作用。
超滤膜大多数是由两层不同结构的薄层组成的非对称膜,
其中,上层很薄,厚度为0.1~1.0μm,称作活化层,其孔径较小,起截留粒子的作用,决定膜的分离性能;下层较厚,厚度为100~200μm,孔径较大,称为支撑层,起增加膜强度的作用根据材料的不同,超滤膜可分为有机膜和无机膜。
一般而言,膜材料应具备良好的成膜性、机械稳定性、化学稳定性、热稳定性以及耐酸碱和耐微生物浸蚀等性能,理想的膜材料还应具有亲水性及蛋白质等生物大分子产生非特异性吸附作用.常用的有机膜包括聚醚砜(PES)膜、聚丙烯PAN)膜、再生纤维素(RC)膜、醋酸纤维素(CA)膜、聚砜(PS)膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等,其中PES膜以高刚性、抗蠕变性、化学稳定性和生物稳定性等优点,常用作超滤的首选膜材料.除有机膜外,无机陶瓷超滤膜也以耐高温、易清洗、耐酸碱、抗生物腐蚀等特点而开始被应用于制药工业和生物技术产业,这种膜是以氧化铝、氧化锆、氧化钛等为材料、采用特殊工艺制成的多孔非对称膜。
随着高分子材料以及成型加工工艺学的不断发展,不同形式的超滤膜组件应运而生,主要有中空纤维式、圆管式、板框式、卷式和毛细管式.
方法步骤:
分子量在1000以下的小肽用0.1%TFA水溶液溶解后,取一定浓度的小肽样品溶液进样至已用流动A液(水+0.1%TFA(V/V/%)平衡过的RP-HPLC色谱上,然后进行凸形梯度洗脱直至达到要求的B液浓度(乙腈+0.1%TFA(V/V/%)。
流动相A、B液需超声脱气后使用。
再用100%B液洗脱30min,使残余在柱上的物质完全冲洗下来,然后再用相应浓度的A液使柱平衡,以构成一个完整的色谱过程。
流速1.0ml/min,大豆肽的检测波长为220nm.16.超滤法:
将水解产物1000mL分别通过三种超滤膜进行分离,分别获得分子量在>20000、20000~10000、10000~6000、<6000四个肽段
(九)密度梯度离心
原理:
密度梯度区带离心法(简称区带离心法),是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。
同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成,介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用的有蔗糖、甘油;密度梯度液的制备用梯度混合器,形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
此法的优点是:
①分离效果好,可一次获得较纯颗粒;②适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒;③颗粒不会挤压变形,能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
方法步骤:
1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3次后,置-20℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后,获取上清夜,然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
3、接着10万g超速离心2h,将沉淀用少量STE溶解。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液,然后在离心管中依次加入30%,45%,60%的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。
11万g离心2.5h,发现在30%与45%以及45%与60%之间都有一条明亮的带,用长针头将两条不同部位的带都吸取出来,分别收集到不同的瓶内。
5、去蔗糖;用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒,然后11万g离心3h,用少量STE(根据沉淀的量决定加入多少)缓冲液把沉淀悬起,即最后获得了纯化的病毒。
-20度冻纯备用,用时可用分光光度计测定其病毒含量。
(十)差速离心法
原理:
根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。
当物体围绕一中心轴做圆周运动时,运动物体就受到离心力的作用。
旋转速度越高,运动物体所受到的离心力越大。
如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转,强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子,会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。
在相同转速条件下,容器中的大小不同的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。
经过一定时间的离心操作,就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。
离心技术是蛋白质、酶分离纯化的常用方法之一
实验方法步骤
1、在电子天平上精确称取约1mg左右样品,加入4ml纯水充分混匀后静置。
自然沉降待上部分清澈后,吸取上清液体至比色皿测定其吸光度值①。
2、将上清液转至1号离心管,400rpm条件下离心3min。
吸取上清至比色皿测定其吸光度值②。
3、将上清液转至2号离心管,10000rpm条件下离心5min。
吸取上清至比色皿测定其吸光度值③。
4、将上清液转至3号离心管,12000rpm条件下离心15min。
吸取上清至比色皿测定其吸光度值④。
二、单一蛋白分离提取的方法
(一)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理:
通过加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的,分离的状态。
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于蛋白质分子量。
所以SDS-PAGE常用来分离指定分子量的蛋白质。
方法步骤:
1.安装夹心式垂直版电泳槽。
各部分依下顺序安装:
装上储槽和固定螺丝销钉,仰放在桌面上; 将长、短玻璃板分别插到硅胶框的凹形槽中。
注意勿用手接触灌胶面,以保持玻璃清洁;将已插好玻璃板的凝胶模平方在储槽上,短玻璃板应面对上储槽;将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
竖直电泳槽,用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂(糖)溶液,封住长玻璃板下端与硅胶膜间的缝隙。
加琼脂(糖)溶液时,应防止气泡进入。
琼脂(糖)溶液用不连续体系电极缓冲液配制。
2.配胶及凝胶板的配制。
(1)配胶。
配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。
(2)凝胶板的配制。
分离胶的制备:
按表配制20mL10%的聚丙烯酰胺(PAA)溶液,混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内,约8cm高,用1mL注射器取少许蒸馏水,沿长玻璃板壁缓慢注入,约3~4mm高,以进行水封。
30min后,凝胶与水封层间出现折射率不同的界线,则表示凝胶完全聚合。
倾去水封层的蒸馏水,再用滤纸条吸去多余水分。
浓缩胶的制备:
配制10mL3%的PAA,混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方,直至距离玻璃板上缘约0.5cm处轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内,约30min后凝胶聚合,再放置20~30min,使凝胶“老化”。
小心拔去样品槽模板,将pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下储槽中,应没过短玻璃板0.5cm以上,即可准备加样。
(电极缓冲液即pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液,内含0.1%的SDS)
3.样品的处理与加样。
样品的处理:
称取0.5~1mg蛋白质加1mL样品溶解液处理,溶解后,在100摄氏度沸水浴中保温3min,取出冷却后取样电泳。
(如处理好的样品暂时不用,可放在-20摄氏度冰箱内保存,使用前在100摄氏度沸水中加热3min,以除去亚稳态聚合物。
)
加样:
(加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握,一般加样体积为10~15uL(即2~10ug蛋白);如样品较稀,加样体积可达100uL。
如样品槽中有气泡,可用注射器针头跳出。
)加样时,将微量注射器的针头穿过电极缓冲液深入加样槽内,应尽量接近底部,轻轻推动微量注射器,注意针头勿碰破凹形槽胶面。
(由于样品溶解液中含有相对密度较大的蔗糖(分离胶聚合后是否进行预电泳,这应根据需要而定。
)
4.电泳。
在电极槽中倒入pH值为8.3的Tris-HCl电极缓冲液(内含0.1%的SDS)即可进行电泳。
在制备浓缩胶后,不能进行预电泳,因预电泳会破坏胶中的pH值环境,预电泳只能在分离胶聚合后进行,应采用分离胶缓冲液。
预电泳后,将分离胶面冲洗干净,然后才能制备浓缩胶。
电泳条件也不同于连续系统,开始时电流为10mA左右;待样品进入分离胶后,改为20~30mA;当燃料前沿距硅胶框底边1.5cm时,停止电泳,关闭电源。
5.凝胶板的剥离与固定
电泳结束后,取下凝胶膜,卸下硅胶框,用镊子撬开短玻璃板,并切下凝胶板的一角作为加样标志。
在两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。
将凝胶板放在大培养皿内,加入固定液,固定过夜。
6.染色与脱色。
将染色液倒入培养皿中,染色1h左右,用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质区带清晰,即可计算相对迁移率。
(二)等点聚焦(IEF)
原理:
分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质(如浓蔗糖溶液)中进行。
在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处,并形成一个很窄的区带。
pH梯度制作一般利用两性电解质,它是脂肪族多胺和多羧类的同系物,它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。
在外电场作用下,自然形成pH梯度。
方法步骤:
1、使用清水冲洗胶条槽,并用牙刷认真刷洗胶条槽内槽以及正负两个电极,并使用Strip HoLderCLeaningSoLution清洗胶条槽,之后用二级纯水冲洗干净,自然晾干,胶槽的盖子同样使用Strip HoLderCLeaningSoLution清洗自然晾干或用吹风机吹干。
2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化储液或用吹风机吹干,置室温溶解,配制水化液。
3、使用brandford法测量蛋白样品的相对上样浓度,计算上样量(每种蛋白样品上样量为150ug)。
将每种蛋白溶液的体积用水化液补充至250uL。
震荡混匀样品后,以13200rpm4℃离心30min。
4、使用酒精擦拭IPGphor的平板电极,以去除表面被氧化的部分,待酒精挥发完全之后备用。
5、从冰箱取出-20℃冷冻保存的干胶条,于室温放置平衡10分钟。
6、胶条槽平行的放在IPGphor的平板电极上,将处理好的样品均匀的加入到胶条槽中,取室温平衡的胶条,用镊子轻轻的去除预制干胶条的保护膜,分清胶条的正负极,胶面向下放入胶条槽中,胶条吸胀15min-30min。
7、在每根胶条上加入1mL覆盖油,可继续吸胀30min,加入覆盖油的作用是防止胶条水化过程中液体的蒸发。
8、将胶条槽的盖子盖上,设置等电聚焦程序。
S1 30V 12h
S2 500V 1h
S3 1000V 1h
S4 8000V 64000Vh
S5 2000V 保持10h 选择胶条数量。
9、聚焦结束的胶条。
(三)双向电泳
原理:
2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
方法步骤:
第一向等电聚焦;
1、使用清水冲洗胶条槽,并用牙刷认真刷洗胶条槽内槽以及正负两个电极,并使用Strip HoLderCLeaningSoLution清洗胶条槽,之后用二级纯水冲洗干净,自然晾干,胶槽的盖子同样使用Strip HoLderCLeaningSoLution清洗自然晾干或用吹风机吹干。
2、从冰箱中
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蛋白质 组学刘福
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)