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壳聚糖酶
微生物壳聚糖酶的研究进展及应用现状
几丁质(chitin)又名甲壳素、甲壳质,是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4-糖苷键相连而成,是地球上仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。
壳聚糖(chitosan)为几丁质脱乙酰化后的产物,是一种阳离子型多糖,也是目前唯一的商品化碱性多糖。
壳聚糖是一种高分子阳离子絮凝剂,由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性,在医药卫生、农业等方面得到广泛的应用。
如可作为离子交换剂,毛发固定剂、保湿剂和柔软剂,药物缓释剂、增溶剂,饲料添加剂,种子处理剂等。
但是壳聚糖的分子量大,水溶性较差,在人体内不易吸收,使其应用受到限制。
而壳聚糖的降解产物壳寡聚糖(Chitooligosaccharides)不仅具有水溶性好、易吸收等优点,近年来更是发现,低分子量壳寡聚糖(如五糖、六糖)具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点,使其在医药领域有着广泛的应用前景。
壳寡糖的制备大多数是以虾、蟹等为原料,经过脱乙酰基等处理得到壳聚糖,再进一步水解得到壳寡糖。
目前,由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种水解方法:
酸解法和酶解法。
酸解法一般是用盐酸部分水解壳聚糖,用甲醇除去水解液中产生的大量单糖,经加Dowex离子交换树脂分离得到壳寡糖。
酸水解法的缺点是反应产物单糖较多,而壳寡糖含量低,反应条件苛刻,工艺烦琐,同时这一工艺由于产生大量废弃酸液,易给环境造成污染。
酶解法是指采用酶制剂在较温和的条件下降解壳聚糖。
一般分为两类:
非专一性水解酶和专一性水解酶。
非专一性酶工艺,是利用如脂肪酶、溶菌酶等壳聚糖非专一性水解酶,降解壳聚糖。
但降解程度有限,而且产物复杂,不易分离,酶量使用大。
专一性水解酶是利用以壳聚糖为专一性底物的壳聚糖酶,专一性水解壳聚糖,该反应条件温和,可通过反应时间控制水解产物,为大规模生产壳寡糖提供了可能,是一种较为理想的壳寡糖制备方法。
壳聚糖酶(Chitosanase,EC.3.2.1.132)是催化壳聚糖降解的专一性酶。
壳聚糖经壳聚糖酶降解后生成低分子量壳寡糖,壳聚糖酶在降解壳聚糖多聚物、大规模生产壳寡糖中发挥着重要作用。
1 壳聚糖酶概述
1.1 壳聚糖酶的发现
Monaghan在研究细菌和真菌过程中,首先提出壳聚糖酶(chitosanase,EC3.2.1.99)是一种不同于几丁质酶的新酶,能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖,被认为是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。
在1992年国际酶学命名会议上,壳聚糖酶被系统命名。
1.2 壳聚糖酶的分布
壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中,现已经从细菌(如Myxobacter,Artyrobacter,Bacillus),放线菌(如Streptomyces、Nocardioides),真菌(如Rhizopus,Penicillum,和Basidiomycete),病毒(ChlorellavirusPBCV-1、CVK-2)中发现壳聚糖酶的存在,并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。
各种来源的壳聚糖酶的性质详见表1[9~27]。
1.3 壳聚糖酶的理化性质
壳聚糖酶的分子量在23~50KD之间,低于几丁质酶的分子量(31~115KD)。
一般来说,从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子量为20000~40000。
但也存在少数高分子量的壳聚糖酶,如曲霉AspergillusfumigatusKH-94有2种壳聚糖酶,其中一种酶的分子量高达108KD。
但不是所有的壳聚糖酶都是单亚基蛋白,如Streptomycesgriesus产生的壳聚糖酶利用变性凝胶电泳测定结果为35000,凝胶过滤结果却为10000,显示这种壳聚糖酶的分子结构及组成可能有别于一般的壳聚糖酶,但是其空间结构尚未确定。
壳聚糖酶大部分为碱性蛋白,等电点(pI)变化范围比较大,在4.0~10.1之间。
最适pH为4.0~8.0,BacilluscirculansWL-12的壳聚糖酶的最适pH为9.5[8]。
而且MyxobacterAL-1的壳聚糖酶有两个最适pH分别为5.0和6.8。
大多数微生物的壳聚糖酶具有较好的热稳定性,最适反应温度在30~60℃之间。
在pH为6.0~8.0,37℃时壳聚糖酶非常稳定,超过40℃后酶很快失活,从Bacillus产生的壳聚糖酶的最适温度大约为60℃。
Bacillussp.strainCK4的壳聚糖酶的耐热性很高,60℃处理30min仍然能保持全部酶活性,80℃处理30min和60min后剩余酶活分别为85%、66%,只有在90℃处理60min后酶才完全失活[9]。
从Bacillussp.KFB-C108纯化的壳聚糖酶其最适温度为55℃,80℃热处理10min或70℃热处理30min酶活性仍然保持稳定,而且酶稳定性也比较强,但Co2+离子能抑制酶的活性。
1.4 壳聚糖酶的催化性质
来源于不同微生物的壳聚糖酶对不同脱乙酰化程度的壳聚糖和壳聚糖相关物(乙二醇壳杂糖、羧甲基纤维素和羟乙基壳聚糖)有不同特异性,但是一般不能降解胶体几丁质和纤维素,这也是判断壳聚糖酶和几丁质酶的一个重要标准。
Hutadilok等研究了壳聚糖酶对部分N-乙酰化的壳聚糖和不同O-取代壳聚糖衍生物的水解作用的动力学行为,在均相反应中,随着N-乙酰度的提高,米氏常数Km增加,而最大反应速度Vmax降低;当N-取代的脂肪族酰基中碳链增长时,Km增加,而Vmax影响很小;对其它衍生物的水解作用则Km为:
O-羧甲基壳聚糖>壳聚糖>O-羟乙基壳聚糖,而Vmax为壳聚糖>O-羟乙基壳聚糖>O-羧甲基壳聚糖。
目前发现的壳聚糖酶大多都是诱导酶,其中一些不仅具有降解壳聚糖活性,还有其它催化作用。
B.subtilisKH1壳聚糖酶则对氨基葡萄糖寡聚体(2~6聚体)具有糖基转移酶活性。
B.circulansWL-12产生的壳聚糖酶同时具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性,酶的主要底物是壳聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖,这种广泛的底物特异性有助于B.circulansWL-12充分降解和利用真菌的细胞壁成份。
这种多酶活性特点可能与生物的不同生长环境有关。
1.5 壳聚糖酶降解壳聚糖的作用方式及产物
壳聚糖酶对壳聚糖的降解方式可分为内切酶和外切酶两种。
大部分壳聚糖酶属于内切酶,降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物,反应速度很大程度上依赖于壳聚糖的乙酰化程度。
在放线菌Nocardiaorientalis和真菌TrichodermareeseiPC-3-7中分离纯化了外切型壳聚糖酶。
但是生物体体内并不一定只存在一种类型的壳聚糖酶。
从AspergillusfumigatusKH94中纯化出2种壳聚糖酶能被壳聚糖酶Ⅰ具有内切酶活性,能水解壳聚糖生成壳二糖;而壳聚糖酶Ⅱ则具有外切酶活性,能水解壳聚糖生成氨基葡萄糖;另外,当反应初始底物中壳聚糖含量高过2%时,壳聚糖酶还具有糖基转移酶活性。
从Aspergillussp.CJ22-326中也分离出了两种内型的壳聚糖酶,且性质类似AspergillusfumigatusKH94。
壳聚糖酶作用部分乙酰化壳聚糖的产物经过减压浓缩后,用柱色谱(如Sephadex)洗脱,将洗脱液浓缩干燥并采用β-氨基葡萄糖苷酶(β-GlcNase)和β-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-GlcNAcase)两种酶作用上述产物,从而可以鉴定出产物还原端的组成和产物的序列,也可以利用亚硝酸降解含有氨基葡萄糖(GlcN)残基不降解含有乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的寡糖进一步确认产物的组成。
1.6 壳聚糖酶的分类
按照对壳聚糖的降解方式,壳聚糖酶可以分为外切酶和内切酶;按照酶的产生又可以分为诱导型(如白僵菌)和组成型(如腐皮镰孢菌)。
但是比较公认的分类方法主要是按照酶作用底物和降解产物来进行分类。
壳聚糖酶最初分为两类,一类只是分解壳聚糖,另一类可以分解壳聚糖和羧甲基纤维素。
但是对壳聚糖酶的研究不断深入,由于壳聚糖酶和其他水解酶(如几丁质酶、溶菌酶、胞外N-乙酰β-D-氨基葡萄糖酶、胞外β-D葡萄糖酶)区分模糊,研究人员建议根据壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的降解性能而分为三类,Ⅰ类酶的产物是杂合寡糖,糖的还原末端为GlcNAc,Ⅱ类酶不产生任何杂合寡糖,Ⅲ类酶的产物也是杂合寡糖,其还原末端为GlcN。
所有研究过的壳聚糖酶有一个共同性质就是要求糖苷键的一侧至少有一个GlcN残基,而不能催化GlcNAc-GlcNAc键的断裂。
这又是壳聚糖酶与几丁质酶的一个重要区别。
1.7 壳聚糖的制备
目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶,基因表达大多受阻遏物/诱导物系统控制,一般以壳聚糖为诱导物,它们的降解产物(GlcNAc或是GlcN)为阻遏物。
因此当以壳聚糖作为唯一碳源时,微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。
根据此理论,筛选产壳聚糖酶微生物多采用“透明圈平板法”:
即采用以壳聚糖为唯一碳源和氮源的固体培养基平板进行富集培养,限制大多数不能利用壳聚糖的微生物生长,而能产生壳聚糖酶的微生物由于能利用壳聚糖的降解产物进行生长繁殖。
在这种白色不透明胶体壳聚糖平板上,由于壳聚糖被微生物降解,在产壳聚糖酶的微生物菌落周围就会形成一个透明圈,通过比较透明圈直径和菌落直径的比值,就可以初步定量的确定产壳聚糖酶活力的大小。
由于天然菌株产壳聚糖酶的能力一般较低,现在大多都使用诱变育种。
大多数的报道都是以壳聚糖作为唯一碳源诱导微生物产壳聚糖酶。
Fenton等[18]用盐酸溶解壳聚糖作为微生物生长的唯一碳源和氮源,诱导Penicilliumislandicum产生了壳聚糖酶。
Pelletier等以片状壳聚糖作为唯一碳源诱导产生了壳聚糖酶,粗酶液的酶活力可达1U/ml。
Shimosaka等用2%的凝胶化壳聚糖培养基诱导Frusariumsolant产生了壳聚糖酶,酶活力高达9.9mU/ml。
Shimosaka还发现氮源的成分对壳聚糖酶的产生有着较大的影响,当在培养基中添加蛋白胨、酵母粉等组成的复合氮源时,菌种产生的壳聚糖酶活力有较大幅度的提高。
中国科学院的杜昱光等人利用蛋白胨、酵母浸膏和干酪素组成复合氮源,诱导球孢白僵菌产生壳聚糖酶。
不同菌种生产壳聚糖酶的产酶培养条件差别不大,一般来讲的产酶最佳温度是28℃~30℃之间,pH在4.0~7.0之间。
Fenton等利用Penicilliumislandicum生产壳聚糖酶时,培养的初始pH为5.5,最佳产酶温度是28℃。
Youshihara等采用假单孢菌生产壳聚糖酶的最佳条件为培养温度为30℃,最佳产酶pH在4.0~7.0之间[18]。
2 壳聚糖酶的分离纯化
目前,国内外在壳聚糖酶分离纯化方面已经做了大量研究,Masashiro等对芽孢杆菌属BacilluscereusS1产壳聚糖酶做了分离纯化和性质研究:
60h后的发酵液3000r离心除去菌体,然后采用90%饱和度的硫酸铵盐析,9000r离心收集蛋白沉淀,将其溶于100ml水中,使用70%冷丙酮进行抽提,沉淀离心收集后采用SephadexG-25和SuperQToyopearl进行分离,收集蛋白活性峰,得到电泳纯的单带蛋白,分子量约为45KD,最适pH为7.0,最适温度为60℃。
该酶不仅能降解壳聚糖,而且对几丁质和纤维素有一定的降解活性。
通过对该酶降解寡聚糖的产物分析,该酶是内切酶,不能降解壳二糖和壳三糖,最小降解底物为壳四糖。
Makoto等对放线菌属Acinetobactersp.StrainCHB101产壳聚糖酶进行了分离纯化工作。
发酵液离心去菌体后,加入70%硫酸铵进行盐析,收集沉淀经过透析后,使用CM-SepharoseCL-6B和SephadexG-100进行分离后,酶液比活提高了16倍,收率为16%,活性蛋白在SDS-PAGE上呈现两条带,一条分子量为30KD,一条为37KD。
前者对壳聚糖有着很高的专一性,而后者则不仅能降解壳聚糖,对于几丁质和纤维素也有不同程度的降解性能。
两种酶均是属于内切酶。
YoonHG等对Bacillussp菌株产壳聚糖酶进行了纯化研究。
发酵液通过30%~70%硫酸铵盐析后,再使用DEAE离子交换层析,Butyl-Toyopearl层析,Tsk-GelHW-55F凝胶过滤,得到了SDS-PAGE上单一条带,酶分子量为38KD。
该酶能降解壳聚糖,但不能降解几丁质和纤维素。
Co2+对酶活有将强影响。
方祥年、杜昱光等研究了球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质。
发酵液通过60%~90%饱和度的硫酸铵沉淀蛋白,收集蛋白透析后通过两次SephadexG-75和Chitosanbead亲和层析,得到了在SDS-PAGE上呈单一条带的纯酶,回收率为18.75%,纯化倍数高达67.5倍。
该酶除较强降解壳聚糖的活性外,能轻微降解CMC和胶体几丁质。
XiaoChen等研究了从Aspergillussp.CJ22-326中壳聚糖酶的分离纯化和性质研究。
采用CM-Sepharose和SephacrylS-200对发酵液进行分离纯化,从中纯化出两种壳聚糖酶。
其中一个酶分子量为29000,另一个为109000。
前者具有内切酶活性,后者这是外切酶活性。
3壳聚糖酶降解产物——壳寡糖的应用
壳聚糖酶是降解壳聚糖的专一性酶,将壳聚糖降解为低分子量的壳寡糖,即由2~10个氨基葡萄糖通过β-1, 4-糖苷键连接而成的低聚糖。
壳寡糖以其独特的生物学功能,在食品、农业、医药等领域有着广泛的用途。
3.1壳寡糖在食品工业中的应用
壳寡糖可作为人体肠道的微生态调节剂,服用壳寡糖能使肠道内的双歧杆菌、乳杆菌等有益军的数量明显增高;壳寡糖具有爽口的甜味,不易被体内消化液吸收,具有很好的保湿性和耐热性,几乎不产生热量,是糖尿病人理想的功能性甜味剂;壳寡糖还具有很好的防腐性,可作为食品防腐剂;由于低聚壳聚糖有许多亲水的游离胺基及羟基,对水有很高的亲和力和持水性,因此可永固果蔬的保鲜,起到保湿,增湿和防腐的作用。
3.2壳寡糖在农业中的应用
在农业生产中,壳寡糖可以诱导植物产生光谱抗性,增强植物自身的防卫能力。
抑制多种病源微生物的生长;还可以作为新型植物生长调节剂,促进植物生长,提高发芽率和抗病性。
Hzdwiger和Beckman研究发现,豌豆的内果皮内含有的壳聚糖酶能够降解F.solani.f.sp.pisi和F.solani.f.sp.phaseoli的细胞壁生成壳聚糖和壳寡糖,对F.solani.f.sp.pisi和F.solani.f.sp.phaseoli具有杀菌作用,并且还可以作为激发子,诱导植物产生植保素。
裘迪红等的研究发现,用低聚壳聚糖处理水稻、玉米,出芽率和产量都明显上升。
用壳聚糖处理冬小麦种子,可增产5%~30%,品质也有提高,如蛋白质增加3.36%,湿面筋增加21.5%,干面筋增加20%。
3.3壳寡糖在医药领域中的应用
在医药方面,小分子壳寡糖具有优良的抗肿瘤活性,特别是六聚糖具有很强的抑制肿瘤的作用。
官杰等以荷瘤小鼠为动物模型进行体内试验,发现质量分数为1.5%[20]COS可明显抑制实体瘤的生长,抑制率达47.17%,COS对肺癌细胞的抑制效果更加明显,体外抑瘤率平均达76%。
壳寡糖还有降胆固醇作用;Liao等[24]通过60名志愿者8周的试验观察发现,在水溶性壳聚糖组(相对分子质量为30000~50000)总胆固醇下降了7.5%,在水不溶性壳聚糖组(相对分子质量为100 000~150 000)总胆固醇下降了8.9%;血清中低密度脂蛋白(LDL)分别下降了10%和6%。
研究发现,几丁质、壳聚糖及其寡糖具有三调(免疫调节、调节pH、调节激素分泌)、三降(降血脂、降血糖、降血压)、三排(排胆固醇、排重金属离子、排毒素)、三抑(抑制癌细胞生长、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素产生)的功能。
此外,壳寡糖还有提高动物机体抗病菌感染的作用,已经发现其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌活性。
4国内外对壳聚糖酶的研究现状
国内对壳聚糖酶的研究处于起步阶段,在筛选产壳聚糖酶的微生物菌种方面做了大量工作,近几年开始转入分子生物学阶段并对酶的动力学性质和酶解作用模式和酶解产物的组成等理论进行研究。
起初从土壤中筛选得到的微生物产壳聚糖酶的活力普遍较低,纯品酶活一般都在5~25U/mg之间,参率一般在1.2~77%。
目前比较高的酶活力有:
中国海洋大学将本实验室保藏的产壳聚糖菌株P003进行复壮,产酶条件优化最后得到的发酵液中壳聚糖酶活力达到108U/ml。
Sun Yuying]首次从土壤中筛选得到一株高产壳聚糖酶的微杆菌属(Microbacterium)在最适产酶培养条件下发酵液中壳聚糖酶活力可达118U/ml,是目前所见报道中产壳聚糖酶活力最高的微生物菌株,并且利用分子生物学手段实现了该菌株在大肠杆菌体内的重组表达,最终获得了具有生物活性的重组蛋白。
国外关于壳聚糖酶的性质研究逐渐从对酶的分离纯化发展到在分子水平上研究产酶基因和酶蛋白的一些特性。
从目前情况看来,研究的最为深入的是放线菌属Streptomyces N174,对其三级结构,活性中心基因都进行了研究,另外,已知三级结构的有Bacillus circulans MH-K1。
5 展望
我国有储量丰富的壳聚糖资源,而且其降解产物壳寡糖的应用范围非常广泛。
目前多采用化学降解法生产壳寡糖,对环境污染严重,产率不高。
采用特异性的壳聚糖酶进行酶法降解壳聚糖制备壳寡糖不仅具有高效、产物质量好等优点,同时还可以降低环境污染。
因此寻找新的专一高活性的壳聚糖酶来源,利用基因工程或诱变手段提高现有壳聚糖酶产量具有重要的意义。
随着研究的深入,人们将会对壳聚糖酶有更加深入的认识,从而带来更大的经济和社会效益。
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- 关 键 词:
- 聚糖