Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对水通道蛋白AQP1调控作用的研究大学毕业论文汇.docx

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Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对水通道蛋白AQP1调控作用的研究

第二军医大学

博士学位论文

Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对

水通道蛋白AQP1调控作用的研究

姓名杨朝旭

申请学位级别博士

专业生物化学与分子生物学

指导教师王红阳

20090501

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

第一部分

摘要

信号转导通路下游转录因子在人神经胶质瘤中对水通

道蛋白调控作用的研究

研究背景和目的

信号转导通路是在脊椎动物的中枢神经系统发育中起至关

重要作用的一条信号通路其在胚胎早期可以通过通路各组分不同时间空间的

特异性表达对多种细胞的命运决定产生影响并且可以与等

信号通路产生相互作用来实现不同细胞定向分化的精细调节信号的

调节紊乱在胚胎期会造成神经系统的发育障碍和畸形在已经成熟的个体则会导

致肿瘤的发生最初是在研究神经胶质瘤时发现并命名的一个基因其编码的蛋白是信号途径最重

要的下游转录因子之一也是信号最终的响应者和功能的执行者

信号通路在神经胶质瘤中处于一种调节紊乱的异常激活状态在胶质瘤的发生发

展中起着重要作用其上游配体信号的存在对于胶质瘤的生长及肿瘤干细胞

的自我更新能力的维持有着重要作用其下游转录因子可以通过调节

的表达水平参与胶质瘤细胞的增殖和凋亡同时也与胶质瘤的恶

性程度和恶性生物学行为的维持密切相关

水通道蛋白是类分布在细胞膜表面能够特异的对

水分子进行快速高效跨膜转运的小分子通道蛋白家族在中枢神经系统中主要分

布的水通道蛋白是近年来的研究发现与神经系统的一些疾病尤其

是肿瘤性疾病的进展有着密切的关系在胶质瘤细胞向周围组织的侵袭生

长及瘤周组织的脑水肿形成方面都发挥了重要的作用虽然已经有大量的研究阐

明了是如何通过自身的通道结构对水分子进行跨膜转运的但是对其本身

表达水平的高低受何种机制的调控尤其是它与主要信号通路之间的关系仍然知

之甚少第二军医大学博士学位论文

本研究拟从一种中枢神经系统最常见的肿瘤神经胶质瘤入手研究

通路的异常激活与水通道蛋白之间的关系旨在证明

通路下游转录因子对的表达具有调控作用阐明这种调控是在何种

水平以何种方式进行并对这种调控作用对神经胶质瘤细胞恶性生物学行为产

生的影响进行了初步探讨

实验方法

用免疫组织化学免疫荧光共定位实验和等方法研究神经

胶质瘤标本中通路的激活情况以及的表达情况并对

两者之间的相关程度进行分析

构建包含启动子区全长的报告基因质粒一

将与报告质粒共转细胞荧光素酶报告基因系统检测对

激活程度的影响

将过表达质粒瞬转细胞收获不同时间点及不同转入剂量的样品

观察转录水平

观察蛋白水平的表达变化

设计合成基因特异的干扰片段构建干扰载体体外验证有效后

研究干扰掉后对报告基因活性及胶质瘤细胞系中表达

的影响

建立分别稳定转染空载体过表达及稳定干扰的三种神经胶

质瘤细胞系一方法检

测三种细胞系中表达水平的变化

将报告质粒转入三种不同的稳定细胞系中检测转录活性的变化

分析启动子区根据的核心结合序列设计引物运用染色质

免疫共沉淀技术研究与启动子区的结合情况

根据实验结果利用重叠延伸技术构建启动子区突变

报告基因质粒转入相应的稳定细胞系中利用报告基因检测确定在

对调控中起关键作用的启动子区段位置阐明调控作用的机

带

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

利用和

实验比较不同细胞系侵袭能力的

差异评价在胶质瘤细胞系中调控表达所引起的生物学功能

变化

实验结果

神经胶质瘤组织标本中和的表达与对照正常组织相比都呈现

出异常高表达的状态并且两者之间的高表达具有特异的相关性

外源瞬时转入及稳定表达都可以在转录和翻译水平上调的表

达并能显著增强含有启动子区全长的报告基因的活性

特异性干扰的表达则可以降低的表达并抑制的报告基

因活性

可以和启动子区中的保守调节序列相结合其中启动

子区位的保守结合序列对维持的调节作用至关重要

表达水平不同的神经胶质瘤细胞系表现出不同的侵袭转移能力在

侵袭能力较低的细胞系中外源性转入可以使其侵袭能力得到恢复

提高提示神经胶质瘤中可能通过上调的表达来增强肿瘤细

胞的恶性生物学特性

结论

本研究首次发现了神经胶质瘤中通路异常活化与异常高表

达两种现象之间的关系并且证实通路下游转录因子可以通过与

启动子区的结合在转录和翻译水平对其表达进行调控其中启动子区

一一一段的序列在这一调控作用中发挥重要作用在胶质瘤细胞中

这一调控作用的生物学意义是可以通过上调来增强胶质瘤细胞的恶

性侵袭能力

关键词信号通路神经胶质瘤转录调节

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

第二部分

摘要

基于结构修饰的靶向通路小分子抑制剂的

筛选研究

研究背景和目的

信号转导通路通路是一条高度保守的在生物的胚胎发育

及多种疾病的发生发展过程中起重要作用的信号通路近年来的研究表明在多

种人类恶性肿瘤性疾病中如脑胶质细胞瘤基底细胞癌胰腺癌非小细胞肺

癌前列腺癌等该通路都呈现出异常的活化状念并且对肿瘤的发生及发生后

肿瘤组织的生长和恶性生物学特性的维持起着重要作用人们在研究通路与

肿瘤之间关系时发现特异性抑制通路可以抑制多种肿瘤细胞的增殖以及向

其他器管侵袭转移的能力因此信号通路被认为是一条比较理想的

可以作为肿瘤靶向治疗的信号途径针对通路的小分子抑制剂的开发及研究

工作方兴未艾逐渐成为国际研究的热点

介芬胺是从藜芦属植物中提取的一种小分子天然产物在化学结

构上属于一种箔体类生物碱可以与通路上游激活因子特异性

结合而抑制该通路信号的传递进而发挥抑制肿瘤细胞的增殖的效应是一种具

有潜在临床应用价值的小分子抑制剂但是作为一种天然产物其抑制

通路活性的作用并不是很强且具有较大的化学毒性这一缺陷限制和延缓了

其作为一种新型抗肿瘤药物的研发与应用

本研究拟以为先导化合物通过结构修饰和改造的方法制备系列目

标衍生物然后对制备的衍生物进行抑制通路的特异性筛选及抗肿瘤活性筛

选并与已有的通路抑制剂的活性进行比较最终期望获得两个

高效低毒高特异性的通路抑制剂并对结构修饰规律作出总结

为新型抗肿瘤药物的研发提供基础第二军医大学博士学位论文

实验方法

结构修饰衍生物的获得以为底物分别经醚化烃化酰化

甲基化氯代等特异性化学修饰得到一系列衍生化合物

衍生物高通量筛选平台的构建在通路组成性激活的细胞系中

稳定转染可以反应通路激活程度的报告基因将该细胞系命

名为并对该细胞系反映通路激活程度的敏感性进行鉴定

初次筛选以步骤中构建的稳定细胞系为筛选工具将步骤中得到的衍

生物以浓度作用于体外培养的后测定报告基因数值

观察各化合物对通路的抑制效应得到可以相对特异性抑制通路活性

的化合物

二次筛选细胞活性检测再次筛选步骤中得到的化合物对体外培养的

的细胞毒性排除初筛过程中报告基因数值的降低是由于化合物

本身的毒性导致细胞死亡所致得到对细胞增殖抑制不明显但可以显著抑

制报告基因活性的毒性低特异性好的衍生物

及检测步骤中得到的化合物对细胞中通

路下游转录因子表达的抑制作用进一步验证化合物的特异性

法检测经二次筛选得到的衍生物在体外对肿瘤细胞的增殖抑制作用

裸鼠荷瘤实验将得到的化合物以不同剂量灌胃给药观察其对体内肿瘤的

生长抑制作用最终得到具有较高的抗肿瘤活性低毒高效的通路抑制

剂

实验结果

以为先导化合物进行化学修饰和改造分离纯化后共得到个衍生

物

报告基因法初筛检测修饰后的化合物对通路的相对抑制作用与阳性对

照药物环杷明相比较共有个化合物显示出与其类似或更

佳的抑制作用

用法再次检测初筛得到的化合物对体外培养细胞的增殖活性的影响

剔除细胞毒性较大的衍生物再次筛选后得到个毒性较低特异性较好的

化合物分别为号化合物号化合物

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

号化合物号化合物

及

结果显示经两次筛选后得到的个化合物可以有效降

低通路下游转录因子的及蛋白表达水平提示其具有良好的

特异性抑制通路活性的作用

在体外肿瘤细胞增殖抑制实验中筛选到的化合物显示出选择性抑制通

路依赖的肿瘤细胞的特性裸鼠荷瘤实验中四种化合物均表现出较好的抑制

肿瘤生长的作用其对体内肿瘤生长的抑制效率如下号化合物为

号化合物为号化合物为号化合物为其

中统计学分析结果表明号化合物对肿瘤生长的抑制作用要优于阳性对照

化合物环杷明

结论

本研究以为先导化合物首先经特异性结构修饰改造得到一系列衍

生物然后对衍生物在抑制通路的特异性体内外毒性抗肿瘤活性等方面

的特性进行连续筛选最终得到四个特异性较好毒性较低抗肿瘤活性较强的

阳性化合物其中有三个化合物在上述特性上与阳性对环杷明类

似一个化合物要优于坏杷明对所得阳性化合物的结构改造位点与先导化合物

的结构进行比较分析可以得出以下规律氧化能够增强化合物的特

异性及抗肿瘤活性但不明显对化合物毒性影响亦不显著化合物的毒性针

对通路的特异性以及抗肿瘤活性主要与与结构中哌啶环的密切相关对

哌啶环的进行结构修饰是发现高效低毒衍生物的重要方向

结构修饰

关键词介芬胺通路小分子抑制剂第二军医大学博士学位论文

第二军医大学博士学位论文

一英文缩略词表

英文全称中文全称

缩写牛血清白蛋白染色质免疫沉淀

环杷明焦碳酸二乙酯改培

养基

二甲基亚砜乙二胺四乙酸胎牛血清多形性胶质母细胞瘤绿色荧光蛋白

免疫组化聚合酶链反应干扰

逆转录聚合酶链反应

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究

工作除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人

已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研究所做的

任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意本人承担本声明

的法律责任

吼

学位论文作者签名才询她

钙月白

学位论文版权使用授权声明

本人完全了解第二军医大学有关保留使用学位论文的规定第

二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和

电子版允许论文被查阅和借阅本人授权第二军医大学可以将学位

论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》《中国优秀博

硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索可以采用影印缩印

或扫描等复制手段保存汇编学位论文保密的学位论文在解密后

适用本授权书

导师签名

学位论文作者虢锄拙

●

一一

喀碧√

日期年曩《月≯≯日

魄叼年乡月日

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

第一部分通路下游转录因子在人神经胶质瘤中对水

通道蛋白调控作用的研究

引言

神经系统是人体最精细结构和功能最复杂的系统由数以亿万计的高度相

互联系的神经细胞组成由于神经系统发育不良及后天的病变导致的各种神经性

疾病尤其是肿瘤性病变已经成为危害人类的主要疾病之一胶质细胞瘤

也称神经胶质细胞瘤起源于神经外胚叶组织是中枢神经系统最为常见的原发

性肿瘤在人类对抗和干预胶质细胞瘤的历史中虽然已形成了一整套以手术为

中心辅以放疗和化疗等多种措施的综合治疗方案但是由于胶质细胞瘤生长

迅速无边界浸润易于复发等特性其治疗预后仍不尽理想据统计胶质细

胞瘤在神经上皮组织肿瘤中约占约占颅内肿瘤的而神经胶质

细胞瘤患者的平均生存期仍少于年因此加强胶质细胞瘤致病机理及发生

发展的基础科学研究为临床治疗提供新的思路和治疗途径对于从根本上提高

本病的治疗效果有着重要意义信号转导通路是在脊椎动物胚胎期神

经发育和分化中起着至关重要的作用的一条信号通路参与脊椎动物神经发育

中细胞命运和胚胎范型的决定在早期途径可以通过不同时空的特异表

达决定神经管中来自腹部区域的细胞发育为运动神经元而来自背区的细胞则发

育为感觉神经元在后期该通路可以通过与其他一些信号因子的协同作用如

等对神经系统细胞的精细分化进行调节在与神经系统的疾

病联系方面在未成熟的个体途径配体的突变将会导致一种叫做前脑

无裂畸形的发育缺陷性疾病对面部和神经系统的中线产生影响在成熟的个

体途径的过度激活是多种神经系统肿瘤发生及恶性生物学行为维持的重要

原因其中包括神经胶质瘤蛋白家族是通路下游具有锌指结构

域的转录因子也是途径在受到外界信号刺激后做出对一系列靶基因进行

调节这一反应功能的最终执行者该蛋白家族中既有激活因子也包括抑制因

子而是通路下游末端重要的转录激活因子其表达水平的高低

是通路激活程度的标志基因由在年发现由于其在脑胶第二军医大学博士学位论文

质瘤中较正常对照组织扩增高出大约倍而得名通路在神经胶质瘤

的发生发展中起重要作用参与调节胶质瘤细胞的生长胶质瘤肿瘤干细胞的自

我更新的维持并与其成瘤能力关系密切

水通道蛋白是分布在生物膜表面能够对水分子进行

高效特异的跨膜转运的一类通道蛋白家族最初在年由等人

对红细胞膜分离纯化多肽时发现随后的研究证明了其特异转运水分子的

功能并将其命名为的发现更新了人们长期以来的水跨生物

膜的移动仪靠单纯扩散的观念使人们一些生理病理的过程及机制有了更加合

理和深刻的认识迄今为止已经在哺乳动物体内发现了种水通道蛋白

在中枢神经系统中主要分布的是在下常生理条件下

在人主要表达于脑脉络膜上皮微绒毛的顶膜与酶共同定位于该组

织在脑脊液产生过程中具有重要作用并参与调节水和离子平衡在发育过程

中从妊娠个月胎儿的脑组织中丌始检测出随后其表达部位和量随月

龄增大而相应变化可能与胎儿脑内水平衡的调节有关在脑的发育中起重要作

用在正常脑组织中的表达水平很低在神经胶质瘤中主要表

达于微血管内皮细胞和瘤性星形细胞在转移瘤的微血管内皮细胞和反应性星形

细胞中表达

主要在神经胶质瘤的进展过程中发挥作用由于胶质瘤细

胞的生长环境是在结构致密空问局限的中枢神经系统所以其向周围组织的浸润

性生长主要依靠其通过变形运动插入到神经元周围的空隙中来实现引表达

水平高的胶质瘤细胞在体内外实验中表现出更强的侵袭转移特性因为此

类细胞具有更强的变形运动能力更有利于向周围组织扩散性增殖此外

还与脑胶质瘤旁的肿瘤周围组织水肿的发生发展有着密切的关系尽管

在脑脊液分泌大脑内水平衡的调节以及胶质瘤的发展中起着重要作用并且

人们对于其自身的通道结构已经有了清楚的了解但是对于其表达的调节机制仍

不清楚尤其是其与主要信号转导通路之间的关系目自订仍然研究的很少在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

信号通路与在中枢神经系统的发育及正常功能的维持中都

起着重要的作用在中枢神经系统胶质细胞瘤的发生发展中两者也都各自体现出

重要的影响但是对两者之间关系的研究目前尚未见报道本课题从神经胶质瘤

组织标本入手首先分析了两者之问的表达的相关性发现了与在

胶质细胞瘤中伴随性高表达这一现象然后通过分子生物学实验对通路通过

其下游转录因子对进行调控的可能性及机制进行研究最后对这种

调控作用对胶质瘤细胞生物学功能的影响进行了初步探讨第二军医大学博士学位论文

材料和方法

一材料

主要化学和生物试剂

普通试剂琼脂糖琼旨公司十二烷基肌酸钠

公司蛋白胨及酵母提取物公司冰乙酸上海试剂一厂

甲醇上海试剂一厂无水乙醇上海试剂一厂碱

公司各种限制性内切酶酶连接酶公司

公司滤纸公司公司硝酸

纤维素膜膜公司等特殊试剂及试剂盒公司

检测系统公司产物纯化试剂盒胶回收试剂盒为上

海赛百盛基因技术有限公司产品各种寡核苷酸链引物使用相关软件

自行设计均由上海生工生物工程有限公司合成测序工作送交

英骏生物技术有限公司完成荧光素酶定量检测试剂盒为

公司产品细胞核染色试剂购自公司溴化乙锭为

转染

公司产品质粒纯化试剂盒公司

试剂公司蛋白定量试剂盒公司细胞活力分

析试剂一购自日本同仁化学研究所细胞侵袭实验板购自

公司细胞外基质试剂购自公司

载体菌株和抗体

购自

载体真核表达载体

质粒为本

为公司产品

实验室所有

宿主菌和均由合作单位德国马普生化所提供

公司单抗购自

抗体抗抗体抗抗体购自

康成生物有限公司羊抗兔及羊抗小鼠二抗购自华舜公司荧光二抗购自

公司

质粒

真核表达质粒由谢经武教授惠赠

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

一表达质粒干扰质粒报告基因质粒

一一一一一质粒均由本室构

建

细胞及培养用主要试剂及制备方法

人胚肾上皮细胞人神经胶质瘤细胞购自中科院细胞库

液体培养基取培养基于粉公司包加入碳

酸氢钠

完全培养基液体培养基添加胎牛血清三抗

三抗青霉素链霉素庆大霉素配成

后的除菌滤膜过滤保存备用

胎牛血清购自公司

胰蛋白酶购自公司

细胞冻存液

液体培养基

二甲基亚砜

主要缓冲液

裂解液

临用前加入

×凝胶加样缓冲液

溴酚蓝甘油

嘶在去离子水中溶解碱和甘氨酸然后加入

的电泳级储存液用离子水补至则成

储存液室温密闭保存

蛋白转移缓冲液甘氨酸碱

甲醇

丽春红三氯

醋酸磺基水杨酸

第二军医大学博士学位论文

封闭液脱脂奶粉溶解

缓冲液的配制

称取碱加入去离子水磁力搅拌下完全溶解

用约

浓盐酸调节值至去离子水定容至

室温保存备用

碱加入去离子水磁力搅拌下完全溶解

称取

用约室

浓盐酸调节值至去离子水定容至

温保存备用

称取加入去离子水磁力搅拌下完全溶

解用约

浓盐酸调节值至去离子水定容至

室温保存备用

加入去离子水磁力搅拌下完全溶

称取

解用约

浓盐酸调节值至去离子水定容至

室温保存备用

处

用

理的去离子水充分溶解加数滴浓调节值至并将体积调节至

保存

在的条件下溶解于去离了

十二烷基磺酸钠

水中加数滴浓盐酸调节值至冷却后去离子水定容至室温

保存

二

主要仪器和设备

仪型

紫外分光光度计

型

一超低温冰箱型

机型

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

各种离心机型型

型

转膜仪

恒温水浴振荡器型哈尔滨东联电子技术开发有限公司

恒温水浴箱一型上海天平仪器厂

超净工作台苏州净化设备公司

凝胶成像系统上海四星生物技术公司

免疫组化石蜡包埋机公司

免疫组化制片仪公司

免疫组化冰冻切片仪公司

荧光实时定量仪公司

荧光素酶检测仪器

紫外透射反射分析仪型上海长明光学电子仪器厂

显微镜荧光显微镜

电泳仪型

型制冰机公司

三二

研究方法针咒万法

标本来源及处理

人神经胶质瘤石蜡包埋组织标本来例源于年月至年月在

长海医院神经外科手术切除的患者经病理组织学检查确诊其中分级

Ⅳ级例其余均为Ⅳ级下常对照两例于正常脑组织内减压术中获得

冰冻组织标本例其中分级级例Ⅱ级例Ⅳ级例Ⅳ

级例正常对照组织例

免疫组织化学

石蜡切片烤箱过夜

切片脱腊至水

二甲苯①一二甲苯②一二甲苯③一乙醇第二军医大学博士学位论文

乙醇一乙醇一乙醇一双蒸水

甲醇液室温放置

×

双蒸水洗

抗原修复

切片放入柠檬酸盐缓冲液中煮沸停火再煮沸

自然冷却至室温双蒸水沈

封闭℃

甩去封闭液不洗直接加一抗置入湿盒中然后冰箱过

夜时

℃取出室温复温×

然后洗

滴抗℃

沈×显色镜下观察

双蒸水终止显色苏木素复染秒

分化后自来水返蓝蒸馏水浸泡

脱水透明盖玻片覆盖

显微镜下观察阳性染色在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

免疫印记

取等量神经胶质瘤组织液氮中磨碎

加入裂解缓冲液冰浴超声破碎细胞

置恒温离心机内离取上清

蛋白定量试剂盒进行蛋白定量取出所需量蛋白加入加样缓冲液

变性

变性样品进行蛋白电泳

通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜公司

脱脂奶粉封闭洗三次每次

稀释一抗孵育洗三次每次

脱脂奶粉稀释二抗孵育洗三次每次

化学发光法显影

细胞培养

胚肾上皮细胞入神经胶质瘤细胞细胞用培养

置孵箱中培养保持饱和湿度

消化取待传代细胞培养瓶皿轻弃培养基预温少许轻洗一遍

弃去加少许胰酶室温放置数分钟至瓶壁出现针孔样

弃去胰酶加少量新鲜培养基终止消化轻轻吹打待成单个细胞后传代

冻存生长对数期细胞约×胰酶消化数分钟用完全培养基中

止吹打成单个细胞离心分钟将细胞沉淀悬浮于冻存

液胎牛血清中转移到冻存管中小

时一℃小时液氮管而后放进液氮中

复苏准备温水视复苏细胞管数多少将从液氮罐中

取出的细胞迅速在水中融化不断搅动转移细胞于加有新鲜完全培养

液的培养瓶中培养次日更换培养液

质粒的构建

启动子区报告基因质粒及突变体质粒的构建方法

启动子区全长及各突变体质粒物见下表其中各突变体质粒采用第二军医大学博士学位论文

重叠延伸法进行构建条件如下变性℃退火℃

延伸℃个循环电泳鉴定

构建方法上游引物均引入酶切位点下游引物均引入酶切

位点得到的产物进行胶回收再用酶切与用同样双酶

切酶切回收后的质粒进行连接转化感受态菌氨苄抗生素

筛选阳性克隆用酶切初步鉴定正确后再送测序鉴定确认突变

位点正确后再用于后续实验

质粒名称引物

一

一

一一

一

一

干扰质粒质粒的构建

人工合成针对人

中部碱基处的反向互补序列端加

端加入粘性木端序列如下合成后上下游寡

入粘性术端

核苷酸链在溶液中于沸水浴中后自然冷却即得到双链的带

粘性末端的

有矛片段质粒用

酶切回收然后进行连接转化感受态菌卡那抗生素筛选阳性

克隆

片段是否接入用测序鉴定鉴定正确后在体外验证其干

扰效果

门一

一

一表达载体的构建在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

网站检索得到序列根据丌放读码框设计引物序列如下

上游引物引入酶切位点下游引物引入酶切位点以抽提的大鼠

肾脏组织为模板扩增胶回收后用

酶切

质粒同样进行双酶切后回收片段载体进行连接然后进行连接转化

感受态菌氨苄抗生素筛选阳性克隆酶切鉴定

细胞转染

脂质体法公司在培养皿中接种适量

细胞使之培养后汇合率达到在不同离心管中分别加入

无血清分别加入肛质粒和脂质体分别混匀后室

温放置

将溶液和脂质体溶液混合轻柔混匀室温放置

转染前细胞用预温的无血清洗涤一遍加入无血

清随后将质粒一脂质体复合物滴加至细胞表面置

孵箱内培养后吸去一脂质体复合物加入含的

培养基继续培养裂解细胞提取总蛋白

法公司在孔培养皿中接种适量使之培

养后汇合率达到在不同离心管中分别加入生理盐水

并混匀随即将溶液加入溶液振

分别加入质粒和

荡混匀室温放置

将质粒脂质体复合物滴加至细胞表面置

孵箱内培养裂解

稳定转染细胞转染后胰酶消化按传代细胞贴壁后加入

培养以维持其性状

两周左右挑取单克隆细胞

抽提

待六孔板中细胞生长至汇合度

室温孵育

加入

加入氯仿剧烈振荡室温孵育

℃离心

吸取上层含有的水相入新管加入异丙醇沉淀室温孵育

离心第二军医大学博士学位论文

弃上清加入

的乙醇洗涤矾沉淀℃离一

水溶解

干燥用

用紫外分光光度计测定的含量保存准备做

∽四∽●

操作步骤

合成第一链

总

随机引物

立星丞

鱼丛

℃

冰浴至少

×

肛

℃

℃

℃

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

反应

取上述合成的

为模板按列反应体系进行扩增

槿拯坠加水至总体积为

轻轻混合预变性变性退火延伸

至个循环℃终木延伸

产物用琼脂糖胶电泳分析

荧光素酶报