ISO2食品安全管理体系非碳酸饮料产品耐酸细菌酵母菌和霉菌分析程序食品安全微生物检测程序.docx

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ISO2食品安全管理体系非碳酸饮料产品耐酸细菌酵母菌和霉菌分析程序食品安全微生物检测程序

ISO22000-2018食品安全管理体系非碳酸饮料产品耐酸细菌、酵母菌和霉菌分析程序【食品安全微生物检测程序】

1.目的PURPOSE

概述非碳酸饮料产品的耐酸细菌、酵母菌和霉菌的分析程序。

TooutlinetheprocedureforanalysisofNCBproductsforAciduricBacteria,YeastandMould.

2.范围SCOPE

本程序适用于需要精确测定存在的耐酸细菌、酵母菌和霉菌的非碳酸饮料产品。

这些有机物有可能导致饮料的腐败。

采用浇灌平板法对这些参数进行分析，酵母菌和霉菌用的是PDA，耐酸细菌用的是OSA。

TheprocedureisapplicabletoNCBproductswhereanaccurateenumerationoftheAciduricBacteria,YeastandMouldpresentisrequired.Theseorganismsmaypotentiallycausespoilageofbeverages.AnalysisfortheseparametersisconductedusingapourplatemethodsusingPDAforYeastandMouldandOSAforAciduricBacteria.

3.程序PROCEDURE

3.1设备Equipment

-无菌移液管–10ml容量

SterilePipettes–10mlCapacity

-无菌的皮氏培养皿–150mm

SterilePetriDishes–150mm

-设定为30°C+/-1°C的恒温箱

Incubatorsetat30°C+/-1°C

-设定为25°C+/-1°C的恒温箱

Incubatorsetat25°C+/-1°C

-恒温水浴，45+/-1°C

ConstantTemperatureWaterbathat45+/-1°C

-高压蒸汽灭菌器Autoclave

-微波Microwave

-纸巾Tissues

-0.2µm过滤器0.2µmFilter

-注射器（5ml或10ml）Syringe（5mlor10ml）

3.2试剂Reagents

-橘汁琼脂（Oxoid或同类产品）

OrangeSerumAgar（OxoidorEquivalent）

-马铃薯右旋糖琼脂（Oxoid或同类产品）

PotatoDextroseAgar（OxoidorEquivalent）

-去离子水DeionisedWater

-乙醇/异丙醇~70%Ethyl/Iso-propylAlcohol~70%

3.3标准Standards

不适用N/A

3.4试验的准备TestPreparation

3.4.1工作台的准备PreparationofWorkstation

层流装置的准备（任选）

LaminarFlowPreparation（Optional）

清洁装置并喷上70%的异丙醇或普通酒精，并用纸巾擦干；或让其蒸发。

保证载片是关闭的，同时打开紫外灯。

务必保证下列条件：

Cleanthecabinetandspraywith70%isopropylorethylalcoholanddrywithtissuesorallowtoevaporate.EnsuretheslidingglassisclosedandturnontheUVlamp.Alwaysensurethefollowing:

-使用紫外线时滑动窗要保持关闭。

KeeptheslidingwindowclosedwhenUVisinuse.

-打开滑动窗之前要关闭紫外灯。

TurnofftheUVlightbeforeopentheslidingwindow.

-样品、培养基或者你本人在任何时候都不得接触紫外线。

Donotexposesamples,mediaoryourselftoUVlightatanytime.

试验之前至少15分钟就要接通装置的鼓风机，以便清除装置中的空气并代之以经过过滤的空气。

TurnONthecabinetbloweratleast15minutesbeforetestingtoallowthecabinetpurgetheairinsidethecabinetandreplacewithfilteredair.

概述General

微生物学化验员洗手并喷上70%的异丙醇或乙醇。

Microbiologyanalystswashhandsandspraywith70%isopropylorethylalcohol.

应当穿上清洁并且适合的专用实验室外套（即袖口和领口都系紧）。

Cleansuitabledesignatedmicrobiologylabcoatsshouldbeworn（i.e.tiedcuffsandcloseduptotheneck）.

利用柔性的家庭用洗涤剂清洗分析区。

Cleananalysisareawithamildhouseholddetergent.

利用70%的异丙醇或普通酒精擦拭分析区，用纸巾擦干或让其蒸发。

Swabanalysisareawith70%isopropylorethylalcoholanddrywithtissuesorallowtoevaporate.

调整试验歧管并与真空烧瓶和真空泵相连（见图1.3）。

Setuptestingmanifoldandconnecttovacuumflaskandpump（seeFig.1.3）

真空泵必须能够形成20–27英寸汞柱或0.2巴的真空度。

Pumpmustbecapableofcreatingavacuumof20-27inchesHgor0.2Bar.

试验之前应当在试验台上摆放下列物品;

Thefollowingitemsshouldbeplacedontheanalysisbenchpriortotesting;

-干净的空容器（废弃物用）

clean,emptycontainer（forwaste）

-开瓶器浸泡在70%的异丙醇或普通酒精中

bottleopenerdippedin70%isopropylorethylalcohol

-70%异丙醇或普通酒精的喷雾瓶

70%isopropylorethylalcoholspraybottle

-样品平板用的托盘

trayforsampleplates

-纸巾tissues

试验台附近应当放两个空箱——一个而用来处理打开样品后的瓶盖和纸巾，另一个用来处理在给样品进行过滤之后的一次性滤膜漏斗的圆柱部分。

Twoemptybinsshouldbeplacedneartestingstation-onefordisposalofcapsandtissuesafteropeningsamplesandtheotherfordisposalofcylindricalsectionofmonitorsafterfilteringsamples.

3.4.3环境监测EnvironmentalMonitoring

-空气平板PDA琼脂AirPlatesPDAAgar

给两个预先浇灌的PDA平板贴上标签并记录在实验室空气监测记录中。

Label2pre-pouredPDAplatesandrecordinLabAirMonitoringrecord.

将一个PDA平板放入样品分析区（靠近歧管），另一个放入样品制备区（打开样品的地方）。

PlaceoneofthePDAplatesinsampleanalysisarea（nexttomanifold）andtheotherinsamplepreparationarea（wheresamplesareopened）.

一旦开始样品分析，就要打开平板的盖子让其曝光30分钟。

Oncesampleanalysisbegins,openlidsofplatesfor30minutesexposure.

盖上平板并将其在25℃+/-1℃条件下倒置培养120小时（5天）+/-3小时。

Closeandincubateplatesinvertedat25°C+/-1°Cfor120hours（5days）+/-3hrs.

或者Or

-空气平板m-Green肉汤AirPlatesm-GreenBroth

给两个0.45µm的一次性滤膜漏斗贴上标签并记录在空气监测记录中。

Label20.45µmmonitorsandrecordinLabAirMonitoringrecord.

分析开始前，将这些一次性滤膜漏斗放在歧管上，给每个滤膜漏斗加入2-3ml的YMB肉汤。

如果使用安瓿，在从上面给每个滤膜漏斗加一份。

Beforeanalysiscommencesplacethesemonitorsonmanifoldandadd2-3mlYMBtoeachmonitor.Ifusingampoules,add1toeachmonitorbythetop.

接通真空源而将肉汤吸入薄膜。

短暂地接通真空源，让培养基渗入薄膜但不要完全渗透吸附垫。

薄膜表面不残留液体是很重要的，因为这会导致菌落扩散，从而不能得到精确的计数。

不要将培养基吸引到吸附垫之外也是重要的，因为这会让薄膜变干并排干培养基，使其不利于有机物的生长。

Turnonvacuumandpullbrothintomembrane.Careshouldbetakentoapplythevacuumbrieflytopullthemediaintothemembranebutnotallthewaythroughtheabsorbentpad.Itisimportantthatnoliquidremainsonthesurfaceofthemembrane,asthiswillcausecoloniestospread,makingitimpossibletogetanaccuratecount.Itisalsoimportantthatthemedianotbedrawnoutoftheabsorbentpadasthiswilldrythemembraneandwilleliminatethemedia,makingitinaccessiblefororganismgrowth.

关闭真空源并取出一次性滤膜漏斗。

Closethevacuumandremovemonitors.

将一个一次性滤膜漏斗放入样品分析区（靠近歧管），另一个放入样品制备区（打开样品的地方）。

Placeoneofthemonitorsinsampleanalysisarea（nexttomanifold）andtheotherinsamplepreparationarea（wheresamplesareopened）.

曝光30分钟后，解开一次性滤膜漏斗的圆柱段，将薄膜部分放到盖子上，盖住平板并在25°C+/-1°C条件下培养120小时（5天）+/-3小时。

After30minutesexposure,disassemblecylindricalsectionofmonitors,placemembraneportionontolid,capandincubateplatesat25°C+/-1°Cfor120hours（5days）+/-3hrs.

3.5样品分析SampleAnalysis

开始分析之前，将OSA和PDA融化并在45℃+1℃的水浴中调整，直到做好使用准备。

Priortocommencinganalysis,meltOSAandPDAandtemperinwaterbathat45°C+1°Cuntilreadytouse.

分析之前，制备要加入到PDA中而将其酸化至pH3.5的酒石酸（10%）；

PreparationofTartaricAcid（10%）tobeaddedtoPDAtoacidifyittopH3.5priortoanalysis;

称取10g的酒石酸并加入100ml无菌的蒸馏水/去离子水。

Weigh10gTartaricAcidandadd100mlsteriledistilled/deionisedwater.

搅拌直至完全溶解。

Mixuntilfullydissolved.

经过一个0.2微米的过滤器过滤而杀菌。

Sterilisebyfilteringthrougha0.2µmfilter.

采用无菌方式，向每100mlPDA中加入18ml酒石酸，也就是向1升PDA中加入18ml酒石酸（调和至45℃）。

Asepticallyadd1.8mlTartaricAcidper100mlPDAi.e.18mlTartaricAcidisaddedto1litrePDA（temperedto45°C）.

取出一部分培养基检查PDA的pH值，利用一个有刻度的pH计来检查pH值。

仪表的示数应当为3.5+/-0.2。

CheckpHofPDAbyremovinganaliquotofmediaandcheckingpHwithacalibratedpHmeter.Itshouldread3.5+/-0.2.

如果是在分析之前制备的，那么培养基就可以直接从高压蒸汽灭菌器转移到水浴中。

Mediamaybetransferreddirectlyfromautoclavetowaterbathifpreparedpriortoanalysis.

在各个样品之前摆放150mm的皮氏培养皿。

从样品上取下1个WinLIMS标签，并将其贴到皮氏培养皿的底部。

Place150mmpetridishesinfrontofeachsample.Remove1WinLIMSlabelsfromsample,andplaceonbaseofthepetridishes.

轻轻地倒置饮料容器。

Gentlyinvertthebeveragecontainer.

对于带皇冠盖的瓶子，要利用大约70%的异丙醇或普通酒精擦拭瓶顶的外侧。

Forbottleswithcrowns,wipetheoutsideofbottletopwith~70%isopropylorethylalcohol.

保证酒精到达皇冠盖的下侧。

Ensurethatthealcoholreachestheundersideofthecrown.

将开瓶器浸泡在大约70%的异丙醇或普通酒精中，然后开启皇冠盖。

Dipopenerin~70%isopropylorethylalcoholandremovecrown.

如果存在着灰尘、锈迹或其它杂质的痕迹，则要用大约70%的异丙醇或普通酒精擦拭瓶子的边缘。

Wipelipofbottlewith~70%isopropylorethylalcoholifthereisanyevidenceofdirt,rust,orotherdebris.

对于易拉罐，要用大约70%的异丙醇或普通酒精擦拭可移动的拉环和邻近表面，并用无菌方式开启。

Forcans,wipetheremovabletabandadjacentsurfacewith~70%isopropylorethylalcoholandopenaseptically.

注：

Note:

开启之后，要废弃≤20ml的饮料来冲掉残留在容器开口附近的任何酒精。

Afteropening,discard≤20mlbeveragetoflushawayanyalcoholremainingaroundthecontaineropening.

以无菌方式，利用吸液泵或吸液球取10ml样品，再倒入皮氏培养皿中。

Drawup10mlsampleasepticallyusingpipettepumporbulbanddispenseintopetridish.

利用无菌方式，向皮氏培养皿中倒入50-55ml调和至44–46°C的桔汁琼脂。

Asepticallypour50-55mlofOrangeSerumAgar,temperedto44–46°C,intopetridish.

顺时针和逆时针轻轻摇动平板，让内含物混匀。

Swirlplategentlyclockwiseandanti-clockwisetomixcontents.

向另一个预先贴有标签的皮氏培养皿中，采用无菌方式吸取10ml同样的样品。

Asepticallypipette10mlofthesamesampleintoanotherpre-labelledpetridish.

采用无菌方式，向皮氏培养皿中倒入50-55ml调和到44-46°C的酸化PDA。

Asepticallypour50-55mlofacidifiedPDA,temperedto44–46°C,intopetridish.

顺时针和逆时针轻轻摇动平板，让内含物混匀。

Swirlplategentlyclockwiseandanti-clockwisetomixcontents.

对所有样品重复上述步骤。

Repeatforallsamples.

让琼脂硬化并倒置平板。

最多堆放6层高。

Allowagartosolidifyandinvertplates.Stackatamaximumof6high.

在将一次性滤膜漏斗或皮氏培养皿放入恒温箱时，每叠之间至少留有2.5cm的距离，并且每叠限高六层或以下。

Whenplacingmonitorsorpetridishesintheincubator,allowaminimumspaceof2.5cmbetweeneachstackandplacestacksrestrictingheighttosixorless.

对于酵母菌和霉菌，将PDA平板在25°C+/-1°C条件下培养120小时（5天）+/-3小时。

Foryeastandmould,incubatePDAplatesat25°C+/-1°Cfor120hours（5days）+/-3hrs.

对于耐酸细菌，将OSA平板在30°C+/-1°C条件下培养48小时（2天）+/-3小时。

Foraciduricbacteria,incubateOSAplatesat30°C+/-1°Cfor48hours（2days）+/-3hrs.

此时应当记录培养的时间和日期，以及样品类型和使用的恒温箱。

Timeanddateofincubationplussampletypeandincubatorusedshouldbeloggedatthistime.

为了避免交叉污染，在样品培养之后，应当实施培养基控制措施。

在主动控制校验之前，应当实施无菌性控制措施。

Toavoidcrosscontamination,mediacontrolsshouldbecarriedoutfollowingincubationofsamples.Sterilitycontrolsshouldbecarriedoutpriortopositivecontrolchecks.

3.5.1日常无菌性控制校验DailySterilityControlChecks

在分析结束时，要对每瓶培养基进行无菌性检测，方法是：

Carryoutsterilitytestsoneachbottleofmediausedattheendofanalysisby;

采用无菌方式，向一个未接种的皮氏培养皿中倒入大约50–55ml的OSA，向另一个未接种的皮氏培养皿中倒入大约50-55ml的PDA。

让其硬化。

Asepticallypouring~50–55mlofOSAintoanuninoculatedpetridishand~50-55mlofPDAintoaseconduninoculatedpetridish.Allowtosolidify.

3.5.2日常主动控制校验DailyPositiveControlChecks

分析结束时，对用于每批样品的每个培养基瓶，进行定性生长支持实验：

Carryoutqualitativegrowthsupporttestsoneachbottleofmediausedforeachbatchofsamplesattheendofanalysis:

采用无菌方式，向一个未接种的皮氏培养皿中导入大约50-55ml的OSA，让其硬化。

Asepticallypour~50