pET28b+载体.docx
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pET28b+载体
pE「28b(+)载体
(基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列)
1.pET28a
载体基本信息:
质粒类型:
大肠杆菌表达载体
表达水平:
高
克隆方法:
多克隆位点,限制性内切酶
载体大小:
5368bp
5'测序引物及序列:
T7:
5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
3'测序引物序列:
T7t:
5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
载体标签:
N-His,N-Thrombin,N-T7,C-His
载体抗性:
Kanamycin(卡那霉素)
N端含有凝血酶(Thrombin)蛋白酶位切点;pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处
病毒类型:
非病毒
2.pET28a载体质粒图谱和多克隆位点信息:
3.pET28a载体简介
pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签,同时含有一个可以选择的C端His标签。
pET28a载体的单一的
多克隆位点见上面的环状质粒图谱。
注意:
载体序列是以PBR322质粒的编码规矩进行编码的,所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是
反向的。
T7RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。
质粒的F1复制子是被定向的,所以在T7噬菌体聚合酶的作用下,
包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生,并启动蛋白表达,同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下终止蛋
白翻译。
3.pET28a载体简介
pET-28a-c(+)载体带有-1个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签,同时N端含有凝血酶(Thrombin)蛋白酶
位切点;pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处
载体描述:
ThepET-28a-c(+)vectorscarryanN-terminalHis?
Tag?
/thrombin/T7?
Tag?
configurationplusanoptionalC-terminalHis?
Tagsequence.Uniquesitesareshownonthecirclemap.NotethatthesequenceisnumberedbythepBR322convention,sotheT7expressionregionisreversedonthecircularmap.Thecloning/expressionregionofthecodingstrandtranscribedbyT7RNApolymeraseisshownbelow.Thef1originisorientedsothatinfectionwithhelperphagewillproducevirionscontainingsingle-strandedDNAthatcorrespondstothecodingstrand.Therefore,singlestrandedsequencingshouldbeperformedusingtheT7terminatorprimer(Cat.No.69337-3).
PET-28a-c(+)向量进行N-末端His?
Tag?
/凝血酶/T7?
Tag?
配置再加上可选的C-末端His?
Tag序列。
独特的网站显示在地图上圈。
请注意,序列编号pBR322公约,所以T7表达区域反循环的地图上。
克隆的表达区域的转录如下所示的T7RNApolymeraseis编码钢绞线。
F1起源是导向,以便辅助噬菌体感染会产生包含对应于编码链的单链DNA病毒。
因此,单个滞留测序应该使用进行T7终结器底漆(猫。
693373号)。
提取pet28质粒时,怎样才能得到高的浓度
Axugen的试剂盒已经很不错了,要是提不出浓度很高的质粒,可以试试下面的一些方法:
1、增加收菌次数,相对提高了质粒的量,这样的话裂解液的量可以适当增加;
2、裂解要充分,变性和复性按说明应该是不超过5分钟,合理控制时间,一般在3分到4分半
的时间都是可以的;
3、过柱子时,吸附的时间尽量长一些,可以在这期间做做其他实验或者吃个饭什么的;
4、如果没有必要,不使用去蛋白液,因为每过一遍柱子,其损耗越大,不过这得根据说明的菌种
而定;
4、最后洗脱回收的时候,要单方面提高浓度,就要适当减少洗脱液的量,我一般都是回收到
40~50卩L的,同时要增加洗脱次数,一般两三次足矣.
如果以上方法都用遍了还无效,就应该考虑菌种本身的问题,是不是冻融或者传代次数过高,
导致质粒本身丢失?
质粒本身在大肠杆菌的拷贝数是多少?
不行的话建议重新将质粒导入到
大肠杆菌感受态细胞中.
一、
实验目的:
扩增pET28质粒先将质粒转化到大肠杆菌中,通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基。
根据质粒带有的抗生素抗性基因,还需要在LB中加入适量相应抗生素,如氨苄青霉素、卡
那霉素等。
LB液体培养基的配方(Luria-Bertani):
称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5
g,NaCI10g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,
高压下蒸气灭菌20分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售,可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化:
1取出感受态细胞(也有商品化感受态销售),冰浴10分钟。
2取连接产物10卩l放入感受态细胞中(100卩1/管),轻轻旋转以混匀内容物,冰浴30
分钟。
342C热休克120秒(按照需要加长或减少时间),不能摇动Ep管。
冰浴5分钟,然
后转移到事先预热至37C的无抗生素的普通LB培养基800ul,50~100rpm37C恒温振荡1小时30分钟。
4用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul菌液铺于含有抗生素的LA平板。
⑤铺菌的LA平板
于37C正放2~3小时,然后倒置培养16-24小时。
⑥将疑似阳性克隆的白斑选出,接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右,做菌液PCR
或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染:
1将3卩l(约4卩g)纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250卩l无血清培养基DMEM(无
双抗)中,轻轻混匀,室温放置5mim。
2再吸取10卩l脂质体溶入250卩l无血清培养基DMEM(无双抗)中,轻轻混匀,室温放置5mim。
3将制备好的DNA与脂质体轻轻混合均匀,室温放置20mim。
然后加入1.5ml无血清
培养基DMEM(无双抗)中,轻轻混匀,即为包裹好的脂质体/DNA。
4将包裹好的脂质体/DNA小心滴加至备用细胞表面,37C,5%CO2,饱和湿度中孵育10
小时。
5弃去混合液,加入含10%胎牛血清的DMEM(无双抗),继续培养24-48小时
(1)目的:
从大肠杆菌中提取质粒DNA(碱裂解法)
(2)实验原理:
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此选用适当浓度和适
当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀,不能有结块,否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle
(微囊)结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性,但如果只用SDS达不到彻底溶解细胞的作
用,加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点:
第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀,同时SDS能与蛋白质结合,平均两个氨基
酸上结合一个SDS分子,所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换
了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS高浓度的盐使沉淀更完全。
同时,由于基因组DNA
很长,容易被PDS共沉淀。
2M的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA一旦发生断裂,小于100kb的片断,就不容易与PDS共沉淀。
所以碱处理的时
间要短,而且不得激烈振荡,否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。
这一步
操作混合均匀后在冰上放置,可以使PDS沉淀更充分。
4、酚/氯仿/异戊醇的作用PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀,酚可以使蛋白质变性,
作用大于氯仿,但水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液,离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收。
加入氯仿后可以增加其比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便
水相的回收。
还有,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。
而用酚/氯仿混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,
微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
异戊醇的添加,主要可以使离心后上下层的界面更加清晰,方便水相的回收。
(3)实验材料、仪器、试剂:
溶液I
50mmol/l葡萄糖,25mmol/lTris•HCl(pH8.0),20mmol/lEDTA(pH8.0)
溶液II:
0.2NNaOH、1%SDS溶液III:
3M醋酸钾、2M醋酸。
(4)操作步骤
1)将细菌沉淀,所得重悬于100卩l用冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。
2)溶液I:
50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制,每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4C。
须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散,将两个微量离心管的管底部互相接触震荡,
可使沉淀迅速分散。
2)力口200卩l新配制的溶液n。
溶液n:
0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS
盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物。
应确保离心管的整个内表面均与溶液n接
触。
不要振荡,将离心管放置于冰上。
3)加150卩l用冰预冷的溶液川
溶液川:
5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口,将管倒置后和地振荡10秒钟溶液川在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4C12000g离心5分种,将上清转移到另一离心管中。
5)可做可不
做:
加等量酚:
氯仿,振荡混匀,用微量离心机于4C以12000g离心2分钟,将上清转
移到另一离心管中。
有些工作者认为不必用酚:
氯仿进行抽提,然而由于一些未知的原因,省略这一步,往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。
振荡混合,于室温放置2分钟。
7)用微
量离心机于4C以12OOOg离心5分钟。
8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时,尽量使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9)用1ml70%乙醇于4C洗涤双链DNA沉淀,按步骤8)所术方法去掉上清,在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC),其产量一般约为:
每毫升原细菌培养物3
—5卩g。
ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA,可取1卩lDNA
碱裂解法提取质粒。
质粒提取(碱裂解法)
(1)取1.5ml菌液于1.5mlEP管中,12000rpmx1min,弃去上清液.(200ul枪头吸下)
(2)加入100ul溶液I,重悬(浑浊状)
(3)向
(2)中加入200ul新制溶液II(现配现用,不得超过3min),轻轻翻转(此时变澄清),4C放置2min(打开后盖上有丝状物)。
(4)加入150ul预冷的溶液III,加盖后温和颠倒数次(产生白色絮状物)。
-20C放置5min。
(5)10000rpmx5min,取上清液于另一干净EP管中。
(6)(避免滴在手上)向上清液中加入等体积(约400ul)酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)
(取下层,在插入枪头后再按下,避免枪头中混有上层保护液,吸出时迅速打入Ep管,防
止滴在外面。
),振荡混匀(轻),12000rpmx3min,将上清液转移至新的EP管中。
(可再次重复,抽取)
(7)向上清液中加入约800ul无水乙醇,混匀,-20C放置20min。
(8)12000rpmx5min,倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
(9)加1ml70%乙醇,吹打沉淀,12000rpmx3min,倒上清液,扣滤纸上。
吸去未倒完乙醇,风干。
(10)(按总量)加入30-50ul,TE缓冲液、1ulRNAse,37C,17min使DNA完全溶解。
-20C保存备用。
1大肠杆菌质粒提取
2质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
3大肠杆菌感受态细胞的制备
4质粒DNA高频转化大肠杆菌
5线形质粒DNA5'-粘性末端去磷酸
6PCR技术
双酶切
(1)分别取两支0.2mlEP管做上记号:
如①②
(2)两个EP管中分别配置下列的30卩L体系:
①
②
水
3ul
水
3ul
10xBuffer
3ul
10xBuffer
3ul
NotI
2ul
NotI
2ul
BamHI
2ul
BamHI
2ul
pET-28a
20ul
pEGFP-N3
20ul
(3)将两只EP管混匀后瞬时离心,放入恒温培养箱37C酶切1h。
琼脂糖凝聚电泳检测酶切结果
取5卩L①②EP管的酶切反应液,同时取5卩L原质粒溶液作对照,进行电泳检测酶切结
果。
胶回收
按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。
胶回收试剂盒使用步骤:
1)在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带,注意刀片需消毒,胶块应尽量小,使之易融化完全;
2)事先将一个eppendof管称重,然后将胶块放入后再次称重,获得胶块的重量;3)以每100mg胶块加入300卩l的量加入BindingBuffer,查看胶块是否浸在液体中;4)56C水浴10min以融化胶块释放DNA,期间每2-3min需取出震荡;
5)待胶块完全融化后按照每100mg胶块150卩I的量加入异丙醇,充分震荡混匀;6)将
HighPureFilterTube安装到CollectionTube上;
7)将所有eppendof管中的液体转移到HighPureFilterTube中去,注意不要超过700卩l,若超过需分两次离心;
8)12000rpm离心1min,倒掉收集管中的液体;9)加入500卩lWashBuffer后再次离心1min;10)倒掉收集管中的液体后再次加200卩l的WashBuffer,12000rpm离心1min;
11)小心将FilterTube取下后装入一个新的Effendorf管上;12)在滤芯的正中加上30
1的ElutionBuffer,室温放置1min,12000rpm离心1min。
DNA的重组连接实验原理和步骤
一、实验目的
用T4dna连接酶将载体pBR322EcoRI-CIP处理的DNA片段,与目的基因5.4KbEcoRI片段连接起来,构建体外重组DNA分子,同时学习几种DNA连接的方法。
二、实验原理
重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中,将
上述二种酶切后的DNA分子进行连接。
(一)DNA连接酶的作用步骤
1.T4DNA连接酶与辅助因子atp形成酶-AMP复合物(腺苷酰酶)
2•酶-AMP复合物再结合到具有5'礪酸基和3'-羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化。
3•产生一个新的磷酸二酯键,把缺口封起来。
(二)DNA的连接方式
在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应,一般是随机的,但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。
连接的方式有:
1.自连
2.两种片段相连
3.三个片段以上的自连与互连
(三)连接反应的条件
1•缓冲液:
一般商品酶都带有10倍的缓冲液,有Mg2+、ATP作为辅助因子,提供能量,同
时也有些保护与稳定酶活性的物质,如DTT(二硫苏糖醇)以防止酶的活性基因氧化失活。
BSA小牛血清蛋白)维持一定的蛋白量,以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。
2•温度:
连接反应温度在37C时有利于连接酶的活性,但是在这个温度下,粘性末端的氢键
结合是不稳定的,EcoRI酶所产生的末端,仅仅通过四个碱基对相结合,这不足以抵抗该温度下的分子热运动。
因此在实际操作时,DNA分子粘性末端的连接反应,其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度,为12〜16C。
3•时间:
12〜16C12〜16小时(过夜);或7〜8C2〜3天。
三•实验材料
1.pBR322EcoRI-CIP处理DNA片段。
2.5.4Kb含有Str的EcoRI回收DNA片段。
3.T4DNA连接酶
四•实验仪器、器皿及试剂仪器、器皿(见附录)试剂:
10XT4DNA连接酶缓冲液
660mmol/LTris-HCI(pH7.5)
50mmol/LMgCl2
50mmol/LDDT
50mmol/LATP
五.实验步骤
1•取3只Eppendof管,一管做重组连接,一管做pBR322未经CIP处理的自连,另一管做pBR322经CIP处理的自连。
2•用微量进样器按下表分别取样各溶液于Eppendof管中。
DNA酶切反应物
10XT4连接缓冲液
ddH2O
T4DNA连接酶
总体积
pBR322EcoRI-CIP
5卩1(100ng)
5.4KbEcoRI片段
5卩1(约400ng)
2卩I
7卩l
1卩l
20卩l
pBR322EcoRI-CIP
31(60ng)
2卩l
14(1l
111
201l
pBR322EcoRI
31l(60ng)
21l
141l
11l
201l
加样顺序为ddH20,10XT4缓冲液,DNA片段,最后加T4DNA连接酶(放于冰浴中)连接酶取好后应立即放回-20C保存。
3.盖紧盖子用手指弹匀Eppendorf管,于台式离心机上转2秒钟,以集中样品。
4•将3管连接样品放入温度12C恒温水浴锅中,过夜。
5•第二天上午各管取约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳,观察连接反应效果,电泳时要加入pBR322EcoRI酶切片段作电泳对照。
重组质粒的连接、转化及筛选
一、材料
外源DNA片段:
自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知;载体DNA:
pBS质粒(Ampr,lacZ),自行提取纯化,浓度已知;宿主菌:
E.coliDH5a,或JM系列等具有a-互补能力的菌株。
二、设备
恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,
电泳仪无菌,工作台,微量移液枪,eppendorf管。
三、试剂
1、连接反应缓冲液(10x):
0.5mol/LTris•Cl(pH7.6),100mol/LMgCl2,100mol/L二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌),500ig/ml牛血清清蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用),10mol/LATP(过滤灭菌)。
2、T4DNA连接酶(T4DNAligase);购买成品。
3、X-gal储液(20mg/ml):
用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20C。
4、IPTG储液(200mg/ml):
在800il蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,
用0.22im滤膜过滤除菌,分装于eppendof管并储于-20C。
5、麦康凯选择性培养基(MaconkeyAgar):
取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全浴解,高压灭菌,待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml,然后摇匀后涂板。
6、含X-gal和IPTG的筛选培养基:
在事先制备好的含50ig/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4ilIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀置于37C下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。
7、感受态细胞制备试剂:
见第三章。
8、煮沸法快速分离质粒试剂:
见第一章。
9、质粒酶及电泳试剂:
见第二章。
第三节操作步骤
一、连接反应
1、取新的经灭菌处理的0.5mleppendorf管,编号。
2、将0.1卩g载体DNA转移到无菌离心管中,加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。
3、加蒸馏水至体积为8卩I,于45C保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。
将混和物冷却至0C。
4、加入10XT4DNAligasebuffer1卩I,T4DNAligase0.5卩I,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16C保温8-24小时。
同时做二组对照反应,其中对照组一只有质粒载体无外源DNA;对照组二只有外源DNA
片段没有质粒载体。
二、E.coliDH5a感受态细胞的制备及转化
每组连接反应混和物各取2卩l转化E.coliDH5a感受态细胞。
具体方法见第三章。
三、重组质粒的筛选
1、每组连接反应转化原液取100卩l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37C下培养半
小时以上,直至液体被完全吸收。
2、倒置平板于37C继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
3、
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- pET28b 载体