miR20a5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖.docx
- 文档编号:4610828
- 上传时间:2022-12-07
- 格式:DOCX
- 页数:5
- 大小:21.17KB
miR20a5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖.docx
《miR20a5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《miR20a5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖.docx(5页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
miR20a5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖
miR—20a—5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖
[摘要]目的观察miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖的影响,并验证其对细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的靶向调控作用。
方法使用LipofectamineTM2000脂质体将微小RNA(miRNA)转染入人肾小管上皮细胞HK-2,实验分为3组,miR-20a-5p组转染miR-20a-5p,对照组转染阴性对照miRNA,空白组未做任何转染。
CCK-8实验检测转染后各组细胞的吸光度值,流式细胞术检测各组的细胞周期变化。
Westernblot检测各组细胞cyclinD1的蛋白表达情况。
构建荧光素酶报告基因,内含cyclinD1的3’端非翻译区(3’UTR),双荧光素酶报告基因实验验证miR-20a-5p对3’UTR的直接结合作用。
结果MiR-20a-5p组在转染后48~120h的吸光度值均低于对照组和空白组(P<0.05),另外两组差异无统计学意义(P>0.05)。
转染后72h,miR-20a-5p组处于G1期的比例为(63.89±3.61)%,高于另外两组(P<0.05),而另外两组差异无统计学意义(P>0.05)。
转染后48h,miR-20a-5p组的cyclinD1蛋白表达减少(P<0.05)。
与阴性对照miRNA相比,miR-20a-5p能抑制荧光素酶的活性(P<0.05)。
结论miR-20a-5p能抑制肾小管上皮细胞的增殖,并将细胞阻滞在G1期,其可能机制是miR-20a-5p抑制cyclinD1的表达,cyclinD1是miR-20a-5p的直接靶基因。
[关键词]细胞周期蛋白D1;细胞增殖;肾小管;微RNAs
[中图分类号]R737.11[文献标识码]A[文章编号]1673-9701(2016)20-0001-05
[Abstract]ObjectiveToobservetheeffectofmiR-20a-5p’sontheproliferationofhumanrenaltubularepithelialcellsandtoverifyitstargetedregulationofcyclinD1.MethodsmiRNAsweretransfectedintoHK-2cells(humanrenaltubularepithelialcell)byLipofectamineTM2000.Cellsweredividedintothreegroups,themiR-20a-5pgrouptransfectedwithmiR-20a-5p,thenegativecontrolgrouptransfectedwithnegativecontrolmiRNAandtheblankcontrolgrouptransfectedwithnomiRNAs.TheabsorbancesofcellsineachgroupaftertransfectionwereevaluatedbyCellCountingKit-8(CCK-8),thecellcyclesofeachgroupwereassayedbyflowcytometry.TheproteinexpressionofcyclinD1ineachgroupaftertransfectionwasdetectedviaWesternblot.Afireflyluciferasereportervectorcontaining3’UTRofcyclinD1wascreatedandtheDual-LuciferaseReporterAssaySystemwasusedtotestthedirectcombinationofmiR-20a-5pand3’UTR.ResultsTheabsorbancesofmiR-20a-5pgroupwerelowerthanthoseofnegativecontrolgroupandblankcontrolgroupat48-120haftertransfection(P<0.05),andtherewasnostatisticaldifferencebetweentheothertwogroups(P>0.05).ThepercentageofG1stageinmiR-20a-5pgroupwas(63.89±3.61)%at72haftertransfection,higherthanthoseoftheothertwogroups(P<0.05),andtherewasnostatisticaldifferencebetweentheothertwogroups(P>0.05).TheproteinexpressionofcyclinD1inmiR-20a-5pgroupwaslowerthanthatoftheothertwogroupsat48haftertransfection(P<0.05).ComparedwithnegativecontrolmiRNA,miR-20a-5prepressedtheluciferaseactivity(P<0.05).ConclusionmiR-20a-5pcaninhibittheproliferationofhumanrenaltubularepithelialcellsandcauseadelayintheG1-stage.ThemechanismmaybemiR-20a-5pcanrepressexpressionofcyclinD1andcyclinD1isthedirecttargetgeneofmiR-20a-5p. [Keywords]CyclinD1;Cellproliferation;Kidneytubules;microRNAs
急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)是重症患者中的一种常见合并症,在ICU中的发病率约20%~60%,住院死亡率常超过25%,死亡率较高[1,2]。
根据改善全球肾脏病预后组织(KDIGO)2012年临床实践指南[3],AKI的定义为:
48h内血清肌酐上升≥26.5μmol/L;或7d内血清肌酐上升至≥1.5倍基线水平;或连续6h尿量<0.5mL/(kg·h)。
AKI的病理生理过程中,肾小管上皮细胞损伤是重要的病理性变化。
细胞损伤后必然会带来细胞周期的激活和自身细胞的增殖修复。
近年来,针对AKI的肾小管细胞损伤修复及细胞周期变化的研究是一大热点[4-7]。
miRNA是一类负性调控信使RNA翻译的小RNA,其与包括AKI在内的几乎所有疾病的发生发展均有密切关系。
本研究旨在探讨miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖及细胞周期的影响,并揭示其对cyclinD1的靶向调控作用。
现报道如下。
1材料与方法
1.1一般材料
所用miRNA均由美国Dharmacon公司合成:
hsa-miR-20a-5p(5’-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’),阴性对照miRNA(5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3’)。
人肾小管上皮细胞HK-2及人胚胎肾细胞293T购自美国模式培养物集存库(ATCC)。
LipofectamineTM2000脂质体购自美国Invitrogen公司。
细胞计数CCK-8(CellCountingKit-8)试剂盒购自日本同仁化学研究所。
细胞周期检测试剂盒(内含碘化丙啶染色液、RNA酶)购自中国碧云天生物技术研究所。
小鼠抗人cyclinD1抗体(sc-20044)购自美国SantaCruz公司。
SDS-PAGE电泳凝胶配制试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所。
荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT购自美国Ambion公司。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养HK-2、293T细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中,培养条件为37℃、5%CO2的培养箱。
每1~2天予以常规换液,待细胞长满80%培养瓶时予胰酶消化传代。
取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.2细胞转染将HK-2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中,整个转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。
实验设3组,转染miR-20a-5p的细胞为miR-20a-5p组,转染阴性对照miRNA的细胞为对照组,不转染miRNA的细胞为空白组。
将脂质体与miRNA充分混合于无血清DMEM培养液,最终加入细胞孔后的miRNA浓度为50nmol/L。
转染6h后PBS清洗细胞,于常规培养液条件下继续培养。
1.2.3CCK-8实验将HK-2细胞以2000个/孔接种于96孔板,每孔使用100μL培养液。
按照前述方法进行转染,分组情况相同。
分别于转染后24h、48h、72h、96h、120h进行检测实验。
检测时每孔加入10μLCCK-8溶液,摇匀后继续在培养箱内培养1h,在酶联免疫检测仪于450nm波长处检测吸光度值。
以加入相同量细胞培养液和CCK-8溶液但没有细胞的孔作为校正参考。
1.2.4流式细胞术观察转染后的细胞周期差异将HK-2细胞接种于6孔板中,转染方法及分组同前。
转染后72h用胰酶将各孔细胞消化下来,转移到离心管中。
1000rpm离心5min,去除上清培养液,以预冷PBS清洗后再次离心,每管加入预冷70%乙醇,于4℃固定12h。
再次清洗离心后去除上清液,每管加入碘化丙啶和RNA酶混合液混匀,37℃避光温浴30min,后于流式细胞仪488nm激发波长处检测红色荧光。
使用流式仪自带软件分析DNA含量。
1.2.5Westernblot检测转染后cyclinD1蛋白表达情况6孔板接种HK-2细胞,分组及转染方式同前。
转染后48h,使用RIPA裂解细胞,离心后移除上清液,BCA法测定蛋白浓度。
根据SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书配好分离胶及浓缩胶。
将测好浓度的蛋白与上样缓冲液混合后煮沸变性5min,以每孔道20μg蛋白于12%SDS-PAGE凝胶中电泳。
电泳条件为60V恒压下30min,后100V恒压下至溴酚蓝到达分离胶底部。
湿转法将蛋白转入PVDF膜,转膜条件为350mA2h。
封闭液在室温下对PVDF膜封闭1h,洗膜后加入cyclinD1抗体或β-actin抗体,4℃震荡摇匀过夜。
洗膜后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体室温孵育2h,再次洗膜后加入ECL试剂,在Bio-Rad凝胶成像仪下检测发光情况。
用Quantity-one软件进行灰度分析,与内参(β-actin)的发光情况比较,得出cyclinD1蛋白的相对表达量。
1.2.6双荧光素酶报告基因实验查找Targetscan、DIANAmicroT等网站,明确cyclinD1能与miR-20a-5p相结合的3’UTR,设计引物,内含SpeI及MluI酶切位点,进行PCR扩增,回收得目的片段。
上游引物为5’-GGACTAGTCTGTTGTAAGAATAGGCATTAA-3’,下游引物为5’-CGACGCGTTCATCCTGGCAATGTGAGAAT-3’。
设计合成一对与miR-20a-5p完全互补的引物,内含有SpeI及MluI酶切位点,经过退火程序后得到阳性片段。
上游引物为5’-GGACTAGTCTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3’,下游引物为5’-CGACGCGTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3’。
将上述两种片段分别行纯化、双酶切后连接入pMIR-REPORT荧光素酶载体。
将载体转化感受态大肠杆菌,提取质粒后将双酶切正确的质粒进行测序,最终得到含有3’UTR的荧光素酶报告基因和含有阳性序列的荧光素酶报告基因。
转染前将293T细胞以4×105个/孔接种于24孔板,将荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒pRL-TK、miRNA联合转染293T细胞,转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。
转染后48h进行双荧光检测,用PLB裂解液裂解细胞,然后加入LARII,于发光仪检测得到荧光值M1。
加入Stop&Glo检测液,启动海肾荧光素酶检测反应,测得荧光值为M2,以M1/M2的值表示报告基因的荧光素酶活性。
1.3统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,使用F检验进行方差齐性检验,多组资料比较使用单因素方差分析,组间两两比较使用LSD法,两组资料比较使用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1CCK-8法检测miR-20a-5p对HK-2细胞增殖的影响
转染后24h,miR-20a-5p组、对照组、空白组的吸光度值的差异无统计学意义(P>0.05)。
转染后48~120h,三组吸光度值的差异具有统计学意义,miR-20a-5p组的吸光度值均低于另外两组(P<0.05),而另外两组的差异无统计学意义(P>0.05)(表1),miR-20a-5p在转染后48~120h抑制了HK-2的细胞增殖(图1)。
2.2流式细胞术揭示miR-20a-5p对细胞周期的影响
转染后72h,流式细胞仪检测发现三组细胞处于G1期的比例具有差异,miR-20a-5p组、对照组、空白组的G1期细胞比例分别为(63.89±3.61)%、(44.18±4.04)%、(46.08±2.49)%,差异有统计学意义(F=29.988,P<0.05)。
miR-20a-5p组的G1期比例高于另外两组(P<0.05),而另外两组差异无统计学意义(P>0.05),说明miR-20a-5p能使HK-2细胞阻滞于G1期。
2.3Westernblot发现miR-20a-5p抑制cylcinD1的蛋白表达
使用β-actin作为内参蛋白,发现转染后48h,miR-20a-5p抑制了cyclinD1蛋白的表达。
miR-20a-5p组、对照组、空白组的蛋白相对表达量分别为(0.12±0.03)、(0.50±0.16)、(0.46±0.12),差异有统计学意义(F=9.280,P<0.05)。
miR-20a-5p组的蛋白相对表达量低于另外两组(P<0.05),另外两组差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。
2.4双荧光素酶报告基因实验揭示miR-20a-5p与cyclinD1信使RNA3’UTR的结合作用
设计与miR-20a-5p完全互补结合的阳性片段,构建含有阳性片段的荧光素酶报告基因(阳性载体),同时将含有miR-20a-5p结合序列的cyclinD1的3’UTR构建为荧光素酶报告基因。
每次转染时均使用海肾荧光素酶质粒pRL-TK共转染,以其荧光值作为内参校正。
miR-20a-5p、阴性对照miRNA分别与cyclinD1报告基因共转染,miR-20a-5p组的相对荧光素酶活性低于另一组,两组的相对荧光素酶活性分别为(125.46±10.29)、(355.33±30.74),差异有统计学意义(t=-12.283,P<0.05)(图3)。
miR-20a-5p、阴性对照miRNA分别与阳性载体共转染时,miR-20a-5p组的相对荧光素酶活性也低于对照组,两组的相对荧光素酶活性分别为(57.34±5.38)、(339.99±17.56),差异有统计学意义(t=-26.655,P<0.05)(图3)。
由于阳性片段能与miR-20a-5p完全结合,且两者共转染时荧光素酶活性低于对照miRNA,说明miR-20a-5p与荧光素酶报告基因结合可以抑制其荧光素酶活性。
所以,miR-20a-5p能抑制cyclinD1报告基因的荧光素酶活性,说明其与cyclinD1的3’UTR可以直接结合。
结果表明,cyclinD1是miR-20a-5p的直接靶基因。
3讨论
在临床实践中,AKI的病因主要有缺血、心脏大手术、药物损害、脓毒症[8-10]。
AKI的病理生理过程较为复杂,包括肾脏灌注压下降、肾小球滤过率(GFR)下降、微循环障碍、内皮细胞损伤等,但如果病因不能去除的话,AKI最终会导致肾小管上皮细胞的损伤、坏死或凋亡[11-13]。
目前有研究提示发生AKI时,正常的处于静止期的上皮细胞可重新进入细胞周期,进行分裂增殖,而非一些干细胞重新增殖分化成新的细胞[14,15]。
从此机制来看,肾小管细胞进入细胞周期增殖,对AKI的恢复具有治疗意义。
但近来的一些研究对这一看法提出了挑战。
Pabla等[16]在顺铂诱导AKI小鼠模型中发现,细胞周期蛋白依赖激酶4/6(CDK4/6)明显激活,CDK6表达增加;CDK6抑制剂palbociclib和ribociclib能诱导细胞周期阻滞,但同时减轻AKI,改善AKI小鼠的生存预后。
CDK抑制因子p21能与几乎所有的Cyclin-CDK复合物结合,包括cyclinD-CDK4/6、cylinE-CDK2,过表达p21能抑制他们的活性,造成细胞周期阻滞在G1期。
Price等[17]发现敲除p21基因的AKI小鼠其形态学损伤更严重,AKI病情进展更迅速,死亡率更高。
抑制细胞周期能改善AKI的具体机制尚不清楚,有待进一步研究。
微小RNA(miRNA)是一种22个核苷酸左右的小RNA,其不具有翻译功能,而是调控信使RNA的翻译。
miRNA与信使RNA的3’端非翻译区(3’UTR)结合,依靠一些酶类造成信使RNA降解或抑制其翻译成蛋白质[18-20]。
miRNA在很多疾病中的表达发生变化,异常表达的miRNA通过调控不同的靶基因对疾病的发生发展产生影响。
本研究将miR-20a-5p转染入正常人肾小管上皮细胞HK-2,CCK-8实验发现在转染后2~5d,细胞生长受到抑制。
随后我们用流式细胞仪检测转染后的细胞,发现miR-20a-5p使细胞处于G1期的比例明显增加。
说明miR-20a-5p通过细胞阻滞于G1期来抑制HK-2的生长。
为了探讨其中的机制,我们查找Targetscan、DIANAmicroT等靶基因预测网站,发现cyclinD1是miR-20a-5p的潜在靶基因。
我们使用Westernblot证实miR-20a-5p可以抑制cyclinD1的蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验证实miR-20a-5p能直接与cyclinD1的3’UTR相结合。
说明miR-20a-5p能与cyclinD1的mRNA直接结合,cyclinD1是miR-20a-5p的靶基因。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- miR20a5p 通过 调控 细胞周期 蛋白 D1 抑制 肾小管 上皮细胞 增殖