S5417肖春林小麦外源染色体片段鉴定方法比较.docx
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S5417肖春林小麦外源染色体片段鉴定方法比较
小麦外源染色体片段鉴定方法比较
肖春林S2*******作物
摘要:
对5种鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的生化和分子标记方法,包括酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)、荧光原位杂交(FISH)、RAPD、特异性PCR标记、和RELP,进行比较研究。
结果表明,5种方法中除了RAPD标记难以鉴定1BL/1RS易位染色体,其他方法都能对1BL/1RS易位染色体进行有效的鉴定。
RFLP和FISH方法比较费时费力且花费昂贵,特异性PCR标记又在一定程度上受模板DNA浓度的影响。
因此认为,酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)方法是一种简单、快速、经济有效的方法,最易于在小麦育种选择中应用。
关键词:
小麦;1BL/1RS易位染色体;特异性PCR标记;A-PAGE;FISH;
RFLP;RAPD
Abstract:
Forfivekindsofappraisal1BL/1RStranslocationchromosomesinwheatbackgroundofbiochemicalandmolecularmarkermethod,includingacidpolyacrylamidegelelectrophoresis(A-PAGE),fluorescenceinsituhybridization(FISH),RAPD,specificPCRmarkers,andRELP,Acomparativestudy.TheresultsshowedthatRAPDmarkersaredifficulttoidentify5ways,inadditionto1BL/1RStranslocationchromosomes,othermethodscaneffectivelyofthe1BL/1RStranslocationchromosomesofidentification.RFLPandFISHmethodistime-consumingandexpensive,specificPCRmarkersandtoacertainextent,affectedbytheconcentrationoftemplateDNA.Thereforebelievethatacidpolyacrylamidegelelectrophoresis(A-PAGE)methodisAsimple,rapid,economicandeffectivemethod,themosteasytoapplicationinwheatbreedingselection.
Keywords:
Wheat;1BL/1RStranslocationchromosomes;SpecificPCRmarkers;A-PAGE;TheFISH;RFLP;RAPD
在全世界范围内,1BL/1RS小麦一黑麦易位系作为优异基因资源在小麦改良中广泛利用。
这主要是由于1BL/1RS易位染色体的1RS片段上不但具有抗条锈病(Yr9)、叶锈病(Lr26)、秆锈病(St31)和白粉病(Pm8)等抗病基因,还携带有提高小麦产量和增强小麦对环境适应性的基因。
在四川省1998-1999年省区试的24个优良新品系中20个新品系含有1BL/1RS易位染色体,可见1BL/1RS易位染色体对四川的小麦改良仍具有重要的作用。
许多方法可用于鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体,包括形态学标记、抗性反应、生化标记,细胞学鉴定,基因组原位杂交、PCR标记等。
广大小麦育种者最关心的是选用一种快速、经济、简单易行的方法来对杂种后代群体进行有效鉴定。
Javornik等对几种鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的细胞学和生化标记方法进行比较研究,认为N-带技术是最费时费力的一种方法,而生化标记则是比较简单快速的方法。
90年代以后,伴随着分子标记技术的发展与成熟,又出现了一些鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的分子标记方法,如荧光原位杂交(FISH)和特异性PCR标记等。
本研究的目的是对酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)、荧光原位杂交(FISH)、RAPD、特异性PCR标记、和RFLP等5种鉴定小麦背景1BL/1RS易位染色体方法进行比较研究,以便为育种者选用1BL/1RS易位染色体的鉴定方法提供理论依据。
一、材料与方法
1.1实验材料
实验材料主要包括秦岭黑麦、多小穗小麦10-A、普通穗型小麦品系88-1643、Aurora、川育12、中国春、以及来源于三交组合10-A/88-1643/川育12后代的一些稳定株系。
1.2方法
1.2.1酸性聚丙烯酰氨凝胶电泳(A-PAGE)
使用ISTA于1986年颁布的APAGE(pH3.2)标准程序,电泳分析醇溶蛋白位点GLd1B3。
Sozinovc1al将GLidlB3这组醇溶蛋白位点定为小麦背景中1R的标记位点。
利用该标记位点来判断是否含1BL/1RS易位染色体。
1.2.2荧光原位杂交(FISH)
利用直接原位杂交法,以中国春总DNA作为封阻DNA,将已标记好的黑麦基因组DNA作探针与根尖有丝分裂细胞染色体进行原位杂交。
荧光显微镜下进行观察,拍照。
1.2.3特异性PCR检测
选用3对小麦背景中1RS的特异PCR标记和1对黑麦1RS基因组特异性SSR引物,对供试材料进行分析。
反应总体积25μL,其中含1UTaqDNA聚合酶(MBI)、1×buffer、1.5mMMgCl2、200μMdNTPs、65rig引物和20-200ng模板DNA。
扩增程序为94℃预变性2min,接着40个循环。
每循环为94℃1min、60℃lmin、72℃2min。
最后72℃延伸10min。
NOR、RIS和J0713对引物由上海生工生物技术有限公司合成,黑麦1RS的SSR引物SCM9由四川农业大学小麦研究所扬足君博士提供。
扩增产物在2.0%或3%的琼脂糖凝胶中电泳,EB染色检测。
1.2.4RFLP分析
取生长旺盛的幼苗叶片提取植株的总DNA含量。
DNA的提取、酶解、跑电泳、Southern转移、探针标记、杂交以及洗膜都采用魏育明等的方法。
共选用13个已定位于第1同源群上的探针,均为单拷贝,进行Southern分析。
1.2.5RAPD分析
选用Operon公司10碱基引物A、D、E、G、C,五组共100条,按照Welsh和MeClelland的方法进行RAPD分析,扩展产物用琼脂糖凝胶电泳,EB染色检测。
二、结果与分析
2.1三种鉴定方法的有效性
2.1.1APAGE分析
采用APAGE方法,对秦岭黑麦、Aurora、10-A、雅安矮10号、88-1643、川育12、异源2号和95-75分析发现。
Aurora、10-A、88-1643、异源2号和95-75具有1BL/1RS易位染色体,而雅安矮10号和川育12则不含1BL/1RS易位染色体。
在这些材料中,Aurora是1个含1BL/1RS易位染色体的前苏联著名面包小麦品种。
这说明APAGE方法能对小麦背景中1BL/1RS易位染色体进行有效鉴定。
利用APAGE方法,对三交组合10-A/88-1643/川育12后代的一些稳定株系进行分析发现,95-69等株系也具有1BL/1RS易位染色体。
2.1.2荧光原位杂交(FISH)
利用普通小麦中国春的总DNA作封阻DNA(封阻DNA:
探针DNA=1:
50),以荧光红标记的黑麦基因组DNA作探针,与95-69根尖有丝分裂细胞染色体进行原位杂交。
结果表明,在根尖细胞有丝分裂的问期和中期,均能清晰地观察到标记的探针与95-69染色体的杂交信号,说明95-69中含有黑麦染色体片段。
同时在有丝分裂的中期细胞中,还可清晰地观察到黑麦的核仁组成染色体的短臂(1RS)易位到95-69中,而在其它染色体上未检测到黑麦的染色体片段存在。
这些结果说明,荧光原位杂交能对95-69的1BL/1RS易位染色体进行有效鉴定。
2.1.3特异性PCR标记检测
分别以20、60、100、150和200ng的中国春和异源2号总DNA为模板,对NOR、RIS、J07I和SCM-9进行引物特异性实验。
结果发现,4对引物中除1对黑麦1RS的R引物SCM-9对模板DNA不敏感外,均能得到1RS的特异性DNA扩增片段,而中国春未出现扩增产物。
在其它3对引物中,当模板DNA为150和200ng时,在中国春中也能扩增出与异源2号相同分子量的DNA片段。
只是存在强弱差异。
表明选3对引物对模板DNA较为敏感,模扳DNA浓度太高时,会出现假阳性反应。
因此,用这3对引物来鉴定小麦背景中的1RS染色体片段时,DNA的准确定量是关键。
2.1.4RFLP分析
选用13个位于第1同源群染色体上的RFLP探针,对中国春、黑麦、88-1643、川育12、10-A等5个材料的基因组DNA的4种限制性内切酶的限制性酶解片段进行Southern分析。
结果表明,所有小麦第1部分同源群染色体短臂上的11个RFLP探针都可以检测到黑麦1RS的特异限制性片段的存在,它取代了缺失的10-A、88-1643中1BS特异限制性片段。
并且,在中国春、川育12号中1BS特异限制性片段并没有发生缺失,因此就没有出现黑麦特异限制性片段。
位于小麦第1部分同源群染色体长臂的2个探针在各种限制性内切酶/探针组合中,4个小麦材料都没有发生特异限制性片段的缺失,也没有出现黑麦特异限制性片段。
利用RFLP标记对三交组合后代进行Southern分析,发现异源2号、95-69、95-75等株系都具有1BL/1RS易位染色体。
这些结果表明,RFLP标记能有效鉴定小麦背景中的1BL/1RS易位染色体。
2.1.5RAPD分析
选用Operon公司10碱基引物A、D、E、G、C等共五组100条,对黑麦、88-1643、川育12号、10-A的总DNA为模版,使用华美生物工程公司、上海生工生物工程公司生产的TapDNA聚合酶进行RAPD扩增。
结果表明,在所选择的所有RAPD引物中,没找到黑麦1RS的特异DNA扩增片段。
这说明,很难用RAPD来标记小麦背景中的1BL/1RS易位染色体。
2.2几种鉴定小麦背景中的1BL/1RS易位染色体的方法比较
在本研究中共采用特异性PCR标记;A-PAGE;FISH;RFLP;RAPD等5种方法来鉴定小麦背景中的1BL/1RS易位染色体,除了RAPD标记外,其他4种方法均能鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体。
从实验操作难易程度、实验花费和耗时方面来看,RFLP和FISH标记技术不但实验操作复杂,需要一定的实验技术,而且花费昂贵、周期较长;其它3种方法操作简单且周期较短。
从检测时期来看,APAGE和FISH能在播种前完成,真正做到外源染色质检测与育种间有效结合;其他的三种方法只能在苗期才能完成。
APAGE与特异性PCR标记相比,在特异性PCR标记检测中部分引物对模扳DNA的量有一定要求。
如果模扳DNA过量则易出现假阳性反应。
由此可见,这几种鉴定1BL/1RS易位染色体的方法中,对多数育种者来说,APAGE是一种最经济有效的检测方法,最易于在育种选择中应用。
三、讨论
Javornik等对鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的N-带技术和其他3种蛋白质电泳方法间进行比较研究,认为蛋白质电泳技术是最为简便有效的方法。
在本研究中,通过对4中分子技术和1种蛋白质电泳技术(APAGE)进行对比分析发现,APAGE是1种最经济有效的检测方法,最易于在育种选择中应用。
虽然1BL/1RS易位染色体具有抗条锈病(Yr9)、叶锈病(Lr26)、秆锈病(Sr31)和白粉病(Prn8)等抗病基因,还携带有提高小麦产量和增强小麦对环境适应性的基因;但是1BL/1RS易位染色体对小麦面包烘烤品质具有不良效应。
因此,育种者的育种目标不同,对该染色体的选择就不同。
如果以优质为主要育种目标,育种者就期望在选择的优良株系中不含1BL/1RS易位染色体。
相反,如果以高产、抗病为主要育种目标。
那么1BL/1RS易位染色体就是育种者所要选择的对象。
利用APAGE方法,育种者一方面能在播种前采用半粒法进行选择,缩小播种量,以达到标记选择与育种相结合;另一方面利用该方法还能从F2代开始对分离群体进行早化选择,大大缩短育种年限、提高育种效率。
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