乳糖微生物限度验证方案.docx
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乳糖微生物限度验证方案.docx
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乳糖微生物限度验证方案
1.目的3
2.范围3
3.职责3
4.参考文件3
5.系统概述4
6.验证用仪器、菌种和培养基4
6.1验证用仪器4
6.2验证用菌种4
6.3验证用培养基4
7.验证实施4
7.1验证文件确认5
7.2需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查6
7.3需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证6
7.4控制菌检查用培养基的适用性检查6
7.5控制菌检查方法验证8
8.偏差清单及报告9
9.验证周期9
10.验证结果分析与评价报告9
11.验证附表10
表1验证方案培训记录表11
表2文件的确认12
表3菌液计数结果13
表4需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录14
表5需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录15
表6控制菌检查用培养基的适用性检查记录16
表7控制菌检查方法验证17
表8偏差清单18
表9偏差报告19
表10验证结果分析与评价报告20
1.目的
依据《中国药典》(2015年版四部),对乳糖新建立的微生物限度检查方法进行验证,以确认在目前的检验环境下该方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌测定及控制菌的检查。
2.范围
本验证方案适用于乳糖的微生物限度检查法的验证。
3.职责
3.1验证小组成员及职责
序号
部门
姓名
职务
验证小
组职务
工作职责
1
质量管理部
刘国利
质量副总
组长
1.负责验证方案、验证报告的最终批准
2.负责验证涉及文件、资料的最终审核
3.确保完成验证项目
2
质量管理部
邓志军
质管部长
副组长
1.负责验证方案、验证报告的审核
2.负责验证涉及文件、资料的审核
3
质量管理部
胡绪勇
主任
小组成员
1.负责验证方案的起草、培训
2.负责验证工作的实施
3.负责验证实施过程中资料数据的收集、整理、归档
4.负责难证项目实施中各部门协调工作
5.负责验证报告的撰写
4
质量管理部
饶滔
主任
小组成员
1.负责验证检验标准、检验方法的起草
2.负责验证实施过程中检验工作的安排
5
质量管理部
阮江为
小组成员
1.负责验证方案、验证报告的初审
2.负责协助验证过程的实施
6
质量管理部
毛亚琼
小组成员
1.负责验证过程实施
2.原始记录的填写
徐秋红
3.2验证方案培训:
本验证方案批准后,根据《人员培训标准操作规程》对确认小组成员和相关人员进行培训,使其了解方案的实施程序,明白其职责并能在验证工作中得到很好的执行。
见表1.
4.参考文件
本验证方案参考了以下标准和指南:
《药品生产质量管理规范》(2010年版)
《药品微生物学检验技术》
《药品生产验证指南》(2003年版)
《中国药典》(2015年版四部)
5.系统概述
参照《中国药典》(2015年版二部及四部)采用的检测方法对葡萄糖原料新建立的微生物限度检查法进行验证,以确认所采用的方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌的测定和控制菌的检查。
可以照此检查法和此检查条件进行供试品的微生物限度检查。
6.验证用仪器、菌种和培养基
6.1验证用仪器
仪器名称
生产厂家
仪器型号
压力蒸汽灭菌器
电子天平
酸度计
电热恒温培养箱
生化培养箱
微生物限度检验仪
6.2验证用菌种
菌种名称
菌种编号
提供厂家
菌种代数
金黄色葡萄球菌
[(B)26003]
北京三药科技开发公司
第()代
铜绿假单胞菌
[(B)10104]
北京三药科技开发公司
第()代
枯草芽孢杆菌
[(B)63501]
北京三药科技开发公司
第()代
大肠埃希菌
[(B)44102]
北京三药科技开发公司
第()代
白色念珠菌
[(B)98001]
北京三药科技开发公司
第()代
黑曲霉菌
[(B)98003]
北京三药科技开发公司
第()代
6.3验证用对照培养基
对照培养基名称
来源
批号
胰酪大豆胨液体对照培养基
中国食品药品检定研究院
胰酪大豆胨琼脂对照培养基
中国食品药品检定研究院
沙氏葡萄糖琼脂对照培养基
中国食品药品检定研究院
沙氏葡萄糖液体对照培养基
中国食品药品检定研究院
麦康凯液体对照培养基
中国食品药品检定研究院
麦康凯琼脂对照培养基
中国食品药品检定研究院
6.4验证用培养基
培养基名称
配制批号
培养温度(℃)
胰酪大豆胨液体培养基
30~35℃
胰酪大豆胨琼脂培养基
30~35℃
沙氏葡萄糖液体培养基
20~25℃
沙氏葡萄糖琼脂培养基
20~25℃
麦康凯液体培养基
42~44℃
麦康凯琼脂培养基
30~35℃
7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
——
0.9%无菌氯化钠溶液
——
7.验证实施
7.1验证文件确认
目的
验证支持文件的确认,用来保证验证的一致性、有效性。
程序
检查《乳糖糖质量标准》、《微生物限度检查法操作规程》、《培养基适用性检查操作程序》及相关记录是否齐全、是否是现行批准的文件。
可接收标准
与本次验证相关的文件及记录齐全,均为现行版本。
确认结果
结果见“表1文件确认”。
7.2需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查
目的
确认使用的需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基适用性检查符合要求。
程序
菌液制备
取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中,经30~35℃培养18~24小时,将培养物1,加入到90.9%无菌氯化钠溶液中,10倍稀释制成每1含菌数不大于100的菌悬液,备用。
取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中,经20~25℃培养2~3天,将培养物1,加入到90.9%无菌氯化钠注射液中,10倍稀释制成每1含菌数不大于100的菌悬液,备用。
取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中,经20~25℃培养5~7天,加入3~5含0.05%()的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管内,取此菌原液1,用含0.05%()的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9,10倍稀释制成每1含孢子数不大于100的孢子悬液,备用。
菌液计数(取2个平皿的平均值):
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌1分别接种至2个无菌培养皿中,每皿注入胰酪大豆胨琼脂培养基约20,倒置于生化培养箱30~35℃培养3天,计数;取白色念珠菌、黑曲霉菌液1分别接种至2个无菌培养皿中,每皿注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约20,倒置于霉菌培养箱20~25℃培养5天,计数并取其平均值。
②计数培养基适用性检查
胰酪大豆胨琼脂培养基取7个无菌平皿,分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2平皿,每皿接种1(含菌不大于100),另一平皿不接种菌作为空白对照,倾注胰酪大豆胨琼脂培养基,混匀,凝固后置于30~35℃培养3天,计数。
取4个无菌平皿,分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2个无菌平皿,倾注胰酪大豆胨琼脂对照培养基,混匀,凝固后置于30~35℃培养5天,计数;对照培养基同法操作。
沙氏葡萄糖琼脂培养基取5个无菌平皿,分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2个平皿,每皿接种1(含菌不大于100),另一平皿不接种菌作为空白对照,倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固后置于20~25℃培养5天,计数;对照培养基同法操作。
可接受标准
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5~2范围内,且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致,则判断该培养基的适用性检查符合规定。
确认报告
结果见“表2菌液计数结果”、”表3培养基的适应性检查”。
7.3需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法的验证
目的
确认所采用的计数方法适合于产品的需养菌总数、霉菌及酵母菌的测定。
程序
菌液制备:
取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中,经30~35℃培养18~24小时将培养物1,加入到90.9%无菌氯化钠溶液中,10倍稀释制成每1含菌数不大于100的菌悬液,备用。
取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中,经20~25℃培养2~3天,将培养物1,加入到90.9%无菌氯化钠注射液中,10倍稀释制成每1含菌数不大于100的菌悬液,备用。
取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中,培养5~7天,加入3~5含0.05%()的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管内,取此菌原液1,用含0.05%()的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9,稀释制成每1含孢子数不大于100的孢子悬液,备用。
②验证步骤:
取供试品1个批号,每批中验证试验包括3组进行独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的比值。
a.试验组:
取1:
10的供试液10加入适量的试验菌液,混匀,使每1供试液中含菌量不大于100,再取1注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,分别制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。
b.菌液组:
取稀释液10,同试验组操作,测定其菌数。
c.供试品对照组:
取1:
10的供试液1,测定供试品菌数。
可接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内。
稀释剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内。
试验组菌数比值=
试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数
菌液对照组平均菌落数
确认报告
结果见”表4需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录”。
7.4控制菌检查用培养基的适用性检查
目的
确认使用的控制菌计数培养基适用性检查符合要求。
程序
①菌液制
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中,经30~35℃培养18~24小时,将培养物1,加入到90.9%无菌氯化钠溶液中,10倍稀释制成每1含菌数不大于100,备用。
②适用性检查
麦康凯液体培养基分别接种1(含菌不大于100)大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中,在42~44℃培养24~48小时,与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好;接种1(含菌大于100)金黄色葡萄糖菌于被检培养基和对照培养基中,在42~44℃培养48小时,试验菌应不得生长。
麦康凯琼脂培养基用涂布法分别接种1(含菌不大于100)大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平皿上,在30~35℃培养18小时,与对照培养皿比较,被检培养皿与对照培养皿生长的菌落大小、形态特征应一致。
用涂布法分别接种不大于100的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平皿上,在30~35℃培养18小时。
被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致
沙门增菌液体培养基分别接种1(含菌不大于100)沙门菌于被检培养基和对照培养基中,在30~35℃培养24小时,与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好;接种1(含菌大于100)金黄色葡萄糖菌于被检培养基和对照培养基中,在30~35℃培养24小时,试验菌应不得生长。
木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基用涂布法分别接种1(含菌不大于100)沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上,在30~35℃培养18小时,与对照培养皿比较,被检培养皿与对照培养皿生长的菌落大小、形态特征应一致。
用涂布法分别接种不大于100的沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上,在30~35℃培养18小时。
被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。
三糖铁琼脂培养基用涂布法分别接种不大于100的沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上,在30~35℃培养18小时。
被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。
可接受标准
1促生长能力检查:
被检培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特征应一致。
2抑制能力检查:
试验菌不得生长。
3指示能力检查:
被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。
确认报告
结果见”表5控制菌检查用培养基的适用性检查”。
7.5控制菌检查方法验证
目的
验证所采用的检查方法适合于产品的控制菌检查。
程序
菌液制备
取大肠埃希菌、沙门的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中,经30~35℃培养18~24小时,将培养物1,加入到90.9%无菌氯化钠溶液中,10倍稀释制成每1含菌数不大于100的菌悬液,备用。
1.验证步骤
供试液的配制:
取供试品10g,加入7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100,使成1:
10的供试液。
试验组:
取1供试液和不大于100试验菌加入100胰酪大豆胨液体培养基中,混匀30~35℃培养18小时,取上述培养物1加入100麦康凯液体培养基中42~44℃培养24小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上,30~35℃培养18小时。
阳性对照组:
取1不大于100试验菌加入100胰酪大豆胨液体培养基中,混匀30~35℃培养18~24,取上述培养物1加入100麦康凯液体培养基中。
42~44℃培养24小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上,30~35℃培养18小时
阴性对照组:
取7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1加入100胰酪大豆胨液体培养基中,混匀30~35℃培养18小时,取上述培养物1加入100麦康凯液体培养基中42~44℃培养24小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上,30~35℃培养18小时。
试验组:
取10g供试品和不大于100试验菌接种至100胰酪大豆胨液体培养基中,混匀,30~35℃培养18小时,取上述培养物0.1接种至10沙门增菌液体培养基30~35℃培养18小时
取少量沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上,30~35℃培养18小时,用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基进行斜面接种30~35℃培养18小时。
阳性对照组:
取1不大于100试验菌接种至100胰酪大豆胨液体培养基中,混匀,30~35℃培养18小时,取上述培养物0.1接种至10沙门增菌液体培养基30~35℃培养18小时
取少量沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上30~35℃培养18小时,用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基进行斜面接种30~35℃培养18小时。
阴性对照组:
取100胰酪大豆胨液体培养基30~35℃培养18小时,取上述培养物0.1接种至10沙门增菌液体培养基30~35℃培养18小时
取少量沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上30~35℃培养18小时。
可接受标准
阳性对照组应检出试验菌,阴性对照组应无菌生长。
若试验组检出试验菌,则可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若试验组未检出试验菌,应消除供试品的抑菌活性后,重新进行验证。
确认报告
结果见”表6控制菌检查方法验证记录”。
8.偏差清单及报告
整理所有验证过程中发现的偏差,并将清单列在“表6”中。
将验证过程发现的所有偏差记录在“表7”,并提出偏差解决方案,审核和批准偏差解决方案及其实施。
9.验证周期
每5年进行一次再验证,原测定法的检验条件发生改变时,也需要重新验证。
10.验证结果分析与评价报告
由验证小组组长对本方案做验证结论及建议,填写“表8验证结果分析与评价报告”,验证小组成员进行会签,验证委员会主任对本方案的结论进行批准。
表1验证方案培训记录表
培训内容
教师姓名
部门
职务
培训时间
培训地点
教师签名
参加培训人员签名
部门
姓名
部门
姓名
表2文件的确认
文件的确认
文件名
文件编号
存放地点
《药用炭质量标准》
《微生物限度检查法操作规程》
《培养基适用性检查操作程序》
结论
检查人
日期
复核人
日期
表3菌液计数结果
菌液计数结果
培养结果(个)
加菌量
菌种
培养基
平皿号
1天
2天
3天
4天
5天
胰酪大豆胨琼脂培养基
金黄色
葡萄球菌
1
2
平均值
枯草
芽孢杆菌
1
2
平均值
铜绿假单胞菌
1
2
平均值
大肠埃希菌
1
2
平均值
沙氏葡萄糖琼脂培养基
白色念珠菌
1
2
平均值
黑曲霉菌
1
2
平均值
胰酪大豆胨琼脂培养基阴性对照
/
沙氏葡萄糖琼脂培养基阴性对照
/
结果
□合格□不合格
结论
检查人
/
日期
复核人
/
日期
表4需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录
需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录
培养结果(个)
加菌量
菌种
培养基
平皿号
被检培养基
对照培养基
比值
1天
2天
3天
4天
5天
1天
2天
3天
4天
5天
胰酪大豆胨琼脂培养基
金黄色
葡萄球菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
枯草
芽孢杆菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
铜绿假单胞菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
白色念珠菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
黑曲霉菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
沙氏葡萄糖琼脂培养基
白色念珠菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
黑曲霉菌
1
/
/
/
/
/
/
/
/
2
/
/
/
/
/
/
/
/
平均值
胰酪大豆胨琼脂培养基阴性对照
沙氏葡萄糖琼脂培养基阴性对照
结果
□合格□不合格
结论
检查人
日期
复核人
日期
表5需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录
需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录
供试品名称
批号
生产厂家
试验方法
平皿法
菌种
加菌量
项目
平均菌落数
结果
1
2
3
金黄色
葡萄球菌
试验组
□合格
□不合格
菌液对照组
供试品对照组
试验组菌数比值
铜绿假单胞菌
试验组
□合格
□不合格
菌液对照组
供试品对照组
试验组菌数比值
枯草芽孢杆菌
试验组
□合格
□不合格
菌液对照组
供试品对照组
试验组菌数比值
白色念珠菌
试验组
□合格
□不合格
菌液对照组
供试品对照组
试验组菌数比值
黑曲霉菌
试验组
□合格
□不合格
菌液对照组
供试品对照组
试验组菌数比值
检查人
日期
复核人
日期
表6控制菌检查用培养基的适用性检查记录
控制菌检查用培养基的适用性检查记录
试验项目
促生长能力
抑制能力
指示能力
菌种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
菌种代数
第()代
第()代
第()代
加菌量()
试验结果
培养基
培养条件
结果
麦康凯液体培养基
培养温度℃培养时间
麦康凯液体培养基
培养温度℃培养时间
麦康凯琼脂培养基
培养温度℃培养时间
麦康凯液体培养基阴性对照
麦康凯琼脂培养基阴性对照
结果
□合格□不合格
结论
检查人
日期
复核人
日期
表7控制菌检查方法验证
控制菌检查方法验证记录
供试品名称
批号
生产厂家
控制菌验证:
大肠埃希菌
供试液制备
取供试品10g,加入7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100,使成1:
10的供试液。
取1:
10的供试液1。
培养基及培养条件
试验组
阳性对照组
阴性对照组
胰酪大豆胨液体培养基
30~35℃
培养18小时
麦康凯液体培养基
42~44℃
培养24小时
麦康凯琼脂培养基
30~35℃
培养18小时
结果
□合格□不合格
检查人
日期
复核人
日期
表8偏差清单
偏差清单
偏差编码
偏差描述
发生偏差的项目
检查人
日期
复核人
日期
表9偏差报告
偏差报告
偏差编码
发生偏差的项目
偏差描述及建议的纠正措施:
验证人员签名
日期
纠正措施的审核和批准:
质监中心主管签名
日期
结果跟踪:
质监中心主管签名
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