CXCL12增进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制研究.docx
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CXCL12增进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制研究
CXCL12增进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制研究
【摘要】目的研究趋化因子CXCL12对人胃癌AGS细胞侵袭性的阻碍。
方式在体外用不同浓度CXCL12处置AGS细胞后,应用Transwell侵袭实验、RTPCR、明胶酶谱分析法、ELISA法,观看CXCL12对肿瘤体外侵袭能力及金属基质蛋白酶MMP9活性和VEGF表达的阻碍。
结果CXCL12作用后,人胃癌AGS细胞侵袭能力明显增强,并具必然的量效关系;金属基质蛋白酶MMP9活性呈剂量依托性增强,VEGF的分泌增加。
结论CXCL12在体外可增加人胃癌AGS细胞的体外侵袭性。
【关键词】趋化因子;CXCL12;胃癌;胃黏膜上皮细胞;金属基质蛋白酶9
ABSTRACT:
ObjectiveTostudytheeffectsofCXCL12ontheinvasionofthehumangastriccarcinomacell(AGScell).MethodsAGScellswerepretreatedwithdifferentconcentrationsofCXCL12invitro,andcellmigrationassay,RTPCR,zymographyandELISAwereusedtoobservedtheeffectsofCXCL12onmotility,invasionandMMP9activityandmRNAexpressionofAGScells.ResultsCXCL12couldincreaseinvasionabilityofAGScellinvitro.TheactivityofMMP9wasincreasedinadosedependentmanner.ThemRNAexpressionofMMP9ofpretreatedAGScellswasupregulated.ConclusionCXCL12couldincreaseinvasionabilityofhumangastriccarcinomacellsinvitro.
KEYWORDS:
Chemokine;CXCL12;Gastriccancer;AGScells;MMP9
肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节,是肿瘤细胞粘附、酶降解基质、移动、基质内增殖等一系列进程的表现[1]。
本研究体外观看了趋化因子CXCL12对肿瘤体外基质金属蛋白酶MMP9活性和VEGF表达的阻碍,以探讨CXCL12增进胃癌细胞侵袭转移的作用机制。
1材料和方式
1.1实验材料
CXCL12购自美国Sigma公司;胰蛋白酶和DMEM培育基(高糖)购自Gibco公司(USA);胎牛血清购自杭州四季青公司(CHINA);TrizolReagent购自TaKaRa公司(JAPAN);MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)、dNTP混合物购自Promega公司(USA);引物序列由上海Invitrogen公司(USA)合成;Transwell侵袭小室购自Costar公司(USA);人工基质胶(Matrigel)购自BD公司(SPAIN)。
1.2实验方式
1.2.1细胞培育
人胃癌AGS细胞购自武汉大学细胞典藏中心(CTCC)。
AGS细胞贴壁培育于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM高糖培育基,37°C、5%CO2饱和湿度条件下培育。
取对数生长期细胞进行实验。
按如下分组进行实验:
空白对照组、50ng/mlCXCL12组和100ng/mlCXCL12组,每组设置3个平行孔。
1.2.2Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力的转变
侵袭能力的测定采纳Transwell侵袭小室:
Matrigel胶(30μg/孔)包被聚碳酸酯膜(8μm孔径)内表面,以此膜分隔上、下小室。
无血清DMEM调整细胞浓度为1×106/ml,在上室中加入100μl细胞悬液,在下室中加入600μl含不同浓度CXCL12的无血清培育液,然后在37°C的培育箱中孵育48h,掏出滤膜,用4%的多聚甲醛固定,棉签擦去滤膜上未贴壁的细胞,甲醛固定5min,HE染色。
400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数,以侵袭细胞的相对数量表示肿瘤细胞侵袭能力。
随机计数5个视野内的细胞数,取平均值进行统计处置,每组计数3份样本。
1.2.3RNA提取和逆转录聚合酶链反映(RTPCR)
RNA提取参照RNATrizol提取试剂盒的操作说明书进行。
提取的RNA纯度由A260/A280比值和%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
取1μgRNA,以OligodT为引物逆转录成cDNA。
反映体系(20μl):
5×MMLVbuffer4μl,dNTP10mmol,RNase20U,MMLV100U,OligodT20pmol,RNA1μg。
逆转录反映条件:
20°C10min,42°C60min,95°C5min。
取2μl的逆转录产物行PCR扩增,以βactin作为内参照。
MMP9引物:
上游5′ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC3′,下游5′GAAGGGGAAGACGCACAGCT3′;βactin引物:
上游5′CCTGGCACCCAGCACAAT3′,下游5′GCCGATCCACACGGAGTACT3′。
PCR反映条件:
95°C5min,94°C60s,57°C45s,72°C60s,35个循环;72°C10min。
2%的琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析系统扫描对PCR产物进行半定量分析,分析结果时以βactin的产物为内对照,计算MMP9/βactin比值。
1.2.4明胶酶谱法分析CXCL12对基质金属蛋白酶(MMP)活性的阻碍
将对数生长期细胞接种6孔培育板,37°C、5%CO2培育24h后,改换含不同浓度CXCL12的无血清培育液培育;继续培育24h后,搜集上清液,离心处置后上清液作为测定的样品,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
制备10%分离胶(含%明胶),5%浓缩胶;样品与缓冲液按2∶1混匀、加样;10mA恒流、4°C电泳至分离胶时换成15mA恒流;至溴酚蓝恰好到胶底处,停止电泳。
分离胶用蒸馏水漂洗2次后加酶缓冲液,置37°C摇床摇36h;水洗,染色、脱色,观看透明带,用凝胶成像仪和LABWOR软件读取透明带并进行定量分析。
1.2.5酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培育上清液中VEGF含量
搜集各组细胞培育上清,置于-20°C保留待测。
ELISA按试剂盒说明书进行操作。
依照试剂盒提供的标准品制作标准曲线。
每孔加入100μl细胞培育上清液,让待测抗原与包被的抗体结合,37°C孵育60min。
洗板4次,每孔加入100μl生物素标记抗体,37°C孵育60min。
洗板4次,每孔加入辣根过氧化酶标亲合素100μl,37°C孵育40min。
洗板4次,每孔加入显色剂100μl,37°C避光显色20min。
在490nm波长检测吸光度(A)值,通过绘制的标准曲线求出待测样本中VEGF浓度(pg/ml)。
统计学分析
所有数据均以±s表示,采纳统计软件进行单因素方差分析,以P<为不同有统计学意义。
2结果
2.1CXCL12对AGS细胞侵袭能力的阻碍
咱们采纳Transwell侵袭小室法检测了AGS细胞侵袭能力的转变,结果发觉:
CXCL12可明显增强AGS细胞的侵袭力。
每200倍视野计数,空白对照组的穿透数为(46±5)个,50ng/ml和100ng/mlCXCL12处置组AGS细胞的穿透数别离为(93±6)个和(115±9)个。
统计学分析说明,50ng/ml组和100ng/ml组与空白对照组间不同有统计学意义(P均<,说明CXCL12能显著增强胃癌细胞的体外侵袭能力。
2.2CXCL12对AGS细胞MMP9mRNA表达的阻碍
PCR反映产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示:
各实验组都可检测到特异性的MMP9mRNA的基因条带;CXCL12能够上调AGS细胞中MMP9mRNA的表达水平,结果见图1。
半定量分析结果显示,空白对照组中MMP9/βaction比值为±%;50、100ng/mlCXCL12处置后,MMP9/βaction比值别离为±%、±%,其表达明显增强,经统计学分析,不同有统计学意义(P均<。
图1CXCL12对AGS细胞MMP9mRNA
表达的阻碍
2.3CXCL12对AGS细胞MMP9活性的阻碍
CXCL12(0、50、100ng/ml)与人胃癌AGS细胞一起培育48h,搜集培育上清液检测金属基质蛋白酶MMP9的活性。
结果显示CXCL12能够增强人胃癌AGS细胞MMP9的活性(图2)。
空白对照组中,MMP9相对表达强度为(±)%,50、100ng/mlCXCL12处置后,MMP9相对表达强度别离为(±)%、(±)%,与空白组比较不同有显著性意义(P均<)。
图2CXCL12对AGS细胞MMP9活性的阻碍
2.4CXCL12对AGS细胞分泌VEGF的阻碍
培育的人胃癌AGS细胞未受到CXCL12刺激时,其细胞培育上清液中VEGF的浓度为±pg/ml;随着CXCL12刺激浓度的增加,人胃癌AGS细胞分泌VEGF浓度也慢慢增高。
当以50ng/ml和100ng/ml的CXCL12刺激时,VEGF浓度别离为±pg/ml和±pg/ml,与空白对照组相较,不同有统计学意义(P<,见图3。
图3不同浓度CXCL12对人胃癌AGS细胞分泌
VEGF(pg/ml)的阻碍
3讨论
趋化因子CXCL12也称为基质细胞衍生因子1(stromalcellderivedfactor1,SDF1),属于β类趋化因子亚家族成员。
CXCL12与受体CXCR4结合后,介导淋巴细胞的定向迁移,在机体免疫和炎症反映进程中发挥重要作用[2]。
最近研究发觉CXCL12/CXCR4在肿瘤的侵袭、转移中发挥重要作用[3]。
温国明等对趋化因子受体CXCR4表达与胃癌预后之间的关系进行了研究,结果发觉:
CXCR4在胃癌标本中阳性表达率为%(76/184例),说明CXCR4的表达与胃癌的分化程度、胃癌淋巴结转移相关[4]。
本实验中,咱们选择表达CXCR4的人胃癌AGS细胞作为研究对象,观看CXCL12对AGS细胞体外侵袭力的阻碍,结果发觉,CXCL12可明显增强AGS细胞的体外侵袭能力。
侵袭性与转移性是恶性肿瘤最重要的生物学行为,也是肿瘤病人致死的要紧缘故[3]。
肿瘤的侵袭和转移包括细胞粘附、蛋白酶水解组织基质和细胞迁移等进程。
金属蛋白酶(MMPs)等多种蛋白水解酶介导的细胞外基质及基底膜的降解,是肿瘤侵袭转移的一个关键步骤。
研究说明[5~7],明胶酶在多种恶性肿瘤组织、培育的肿瘤细胞及癌基因转化细胞中活性增强,体外侵袭实验均证明肿瘤细胞的高侵袭能力与明胶酶的活性增强有关,因此被以为可能是肿瘤侵袭、转移进程中的要紧蛋白水解酶。
本研究中对AGS细胞上清液进行明胶酶谱分析,对照组AGS细胞培育上清仅见微弱负染条带,说明AGS细胞自分泌少量MMP9,活性较弱,当给予CXCL12刺激时,基质金属蛋白酶MMP9的活性慢慢增强。
说明CXCL12可增加基质金属蛋白酶的表达与分泌,从而增进胃癌肿瘤的侵袭和转移。
肿瘤组织的生长及侵袭转移需要新生血管的生成以保证足够的氧供和营养物质供给,而血管生成是一个严格操纵的生物学进程,它同肿瘤的生长和转移紧密相关。
血管内皮细胞生长(VEGF)在血管形成中发挥重要的作用[8]。
咱们采纳ELISA法检测AGS细胞培育上清中VEGF含量,发觉CXCL12刺激AGS细胞后,可增加VEGF的分泌。
说明CXCL12可使肿瘤内VEGF的生成和分泌增加,增进肿瘤的生长和侵袭。
以上的结果说明,CXCL12能够通过诱导胃癌细胞生成和分泌基质金属蛋白酶MMP9和VEGF,致使肿瘤细胞侵袭能力的增加,进而致使了胃癌高度侵袭性的生物学行为。
【参考文献】
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117(收稿日期:
20200613)
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