动物药成分分析.docx
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动物药成分分析
动物药成分分析
名词解释
1、动物药物:
以动物体、组织、器官、分泌物、衍生物、代谢物等为原料,提取有效成分,制成治疗疾病的药物。
2、药用动物:
指身体全部或局部可以入药的动物。
3、有效成分:
有明显生物活性,发挥药效作用的化学成分。
4、无效成分:
无明显生物活性,不发挥药效作用的化学成分。
5、微透析技术(MD):
是一种利用膜透析原理,微量地对细胞液进行连续性采样的新型采样和色谱样品制备技术。
6、超滤:
利用压力活性膜,在外界推动力(压力或离心力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量较大的物质,而水和分子量较小的溶质颗粒透过膜。
7、生物碱:
广义上,生物界除了生物体必须的含氮化合物,如多肽、蛋白质和B族维生素等外,其他所有的含氮有机化合物都可视为生物碱。
8、甙类(苷类):
水解后能生成糖和非糖化合物的物质的统称。
9、原生甙:
原存在于机体内的甙。
10、次生甙:
含有两个以上糖的原生甙,经水解后失去一部分糖而得到的甙。
11、皂甙:
是一类特殊甙类,它的水溶液振摇后能产生大量持久不消失的肥皂样泡沫。
12、萜类:
自然界存在的一类具有(C5H8)n通式的碳氢化合物,及其含氧饱和程度不等的衍生物的总称。
13、单萜:
含2个异戊二烯单位的萜类。
14、二倍半萜:
是萜类家族中最新最少的一员,含5个异戊二烯单位的萜类。
15、四萜:
含8个异戊二烯单位的萜类,分子中存在一系列共轭双键发色团,故具有颜色。
在动物机体内主要指类胡萝卜素。
16、挥发油:
亦称精油,是一类具有挥发性、可随水蒸气蒸馏出来的油状液体的总称。
绪论
1、动物药的特点
(1)疗效确实
(2)生理活性强
(3)应用面广
1)治疗神经系统疾病——镇静止痛:
蝎子、林蛙油(雌性输卵管)
2)治疗心血管疾病——强心降压:
麝香、蝉乳、鹿茸(中等剂量)
3)治疗血液及造血系统疾病——补血止血:
水蛭、五倍子、阿胶(提高血红蛋白)
4)治疗呼吸系统疾病——止咳平喘化痰:
紫河车、地龙、蛇胆、凤凰衣(蛋壳中的卵膜)、猪蹄甲
5)用于微生物感染疾病——消炎:
蝉蜕、蜈蚣
6)用于治疗肿瘤:
斑蝥、蝎子、蟾酥、蛇毒
(4)潜力大
(5)毒副作用小(正确使用的前提下)
(6)药物来源及使用广泛
2、动物药的入药部分
(1)全身入药者(昆虫类、软体动物):
水蛭、海马、地龙、斑蝥、全蝎
(2)器官入药者:
熊胆、獭肝、海狗肾、紫河车
(3)组织入药者:
鸡内金、刺猬皮、乌贼骨
(4)衍生物入药者:
鹿茸、羚羊角、山甲皮
(5)分泌物入药者:
麝香、蜂王浆、蟾酥、龙涎香、蛇毒
(6)排泄物入药者:
五灵脂(复齿鼯鼠粪便)、白丁香(麻雀)、望月砂(野兔)、夜明砂(蝙蝠)
(7)病理产物入药者:
牛黄、珍珠、僵蚕、虫草、马宝、狗宝
(8)加工品入药者:
阿胶、鹿茸胶、龟板胶、鹿胎膏、血余炭
3、动物药材市场特点:
需求增长,但资源紧缺,产不足需,供需缺口连年加大,尤其是一些濒危品种的产物已趋枯竭,许多珍贵动物药材价格开始大幅度上涨。
4、我国动物药研究的趋势和特点(解决措施)
(1)重视药用动物生态坏境和生物学特征的研究,扩大药用动物种群数量,提高动物药材的质量。
•原地复壮、引种放养、变野生为家养。
(2)研究动物药代替品
•同属动物、人工合成品、药材加工副产品、相似疗效药品代替正品
(3)利用现代生物技术手段扩大药源。
(4)积极展开海洋动物药的研究。
(5)加强动物保护知识宣传,制定合理的狩猎、捕捉政策。
(6)对药用动物产品的初加工单位或企业加强管理,改善初加工条件,加强药用产品的深、精加工。
第一章动物药成分提取分离的一般方法
1、生物材料的保存方法及丧失活性的原因
(1)保存方法
1)冷冻保存,-40℃急冻后-20℃冷冻保存
2)干燥保存
3)冷冻干燥保存(真空冷冻干燥机)
4)有机溶剂浸泡保存
(2)丧失活性的原因
1)组织细胞自溶作用,使目的分子失活
2)微生物的污染,使目的分子失活
3)空气中的氧化作用,使分子结构发生变化
4)使用的工具和容器与目的分子发生化学变化
2、试述提取动物药有效成分常用的方法
一、传统提取方法
(一)溶剂提取法
(1)定义:
根据动物药中各种成分在溶剂中的溶解性质,选用对活性成分溶解度大,对杂质溶解度小的溶剂,将有效成分从药材组织内溶解出来。
(2)溶剂的分类
(3)选择溶剂的要点
1)对有效成分溶解度大,对杂质溶解度小;
2)不能与中药成分起化学反应而影响有效成分药效;
3)沸点适中,易回收;
4)廉价易得、安全无毒。
(4)溶剂提取方法
1)浸渍法:
溶剂多为水或稀醇。
适用于有效成分遇热易破坏、挥发或粘质多的药材;浸出率差,提取液易发霉变质。
2)渗滤法:
粉碎药材→湿润药材→装渗滤筒→加液,排气,浸泡24h→收集滤液
浸出率高,且溶剂可套用;溶剂消耗量大,费时,操作麻烦。
3)煎煮法:
方便简单,效率高;含挥发性成分或有效成分遇热易破坏中药不适用,粘液质较多的中药煎煮后较粘稠不易过滤。
4)回流提取法:
减少溶剂消耗,提高浸出效率;受热易破坏成分不适用,消耗量大,操作麻烦。
5)连续回流提取法:
受热易分解成分不适用。
(5)影响因素:
粉碎度、温度、离子强度、酸碱度、时间。
(二)水蒸气蒸馏法:
适用于具有挥发性的,能随水蒸气蒸馏而不被破坏的,与水不发生反应的,且难溶或不溶于水的成分。
(三)升华法
(四)传统提取方法的主要缺点
(1)可供选择的提取溶剂种类较少;
(2)提取温度高,时间长;
(3)提取步骤多,流程长,生产效率低,产物损失大;
(4)传统提取多采用静态提取,存在平衡浓度限制;
(5)溶剂/原料用量比大。
二、现代提取方法
(一)超声波提取法
(1)原理:
超声波具有强烈的振动和击碎作用,可以把物体打成极为细小的微粒,起到起到助溶的作用。
(2)优点:
效率高,时间短,可避免高温高压对有效成分的破坏,操作简单方便。
(3)缺点:
应对超声波频率、超声时间、提取溶媒等条件进行考察,以提高提取效率。
(二)超临界流体萃取法
(1)超临界流体:
指在高于临界压力和临界温度时所形成的单一相态,既不是气体,也不是液体,但兼有气体和液体的某些性质,即兼有气体的低粘度,液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数,流体的表面张力为0等特征。
(2)原理:
利用流体在临界点附近某区域内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能,且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动,利用这种SCF作溶剂,可以从多种液态和固态混合物中萃取出待分离组分。
(3)超临界流体萃取仪组成:
泵、萃取池、收集器。
(4)优点
1)无有机溶剂残留,产品纯度高,操作简单,节能;
2)与色谱、光谱等分析仪器直接联用;
3)提取成分范围广。
(三)微波辅助提取法:
微波提取过程中,微波辐射导致细胞内的极性物质,产生大量热能,使细胞内温度迅速上升,液态水气化产生压力将细胞膜冲破,形成微小的孔洞;进一步加热,导致细胞内部水分减少,细胞收缩,表面出现裂纹。
孔洞和裂纹的存在使细胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内产物。
注意:
微波功率和辐射时间对提取效率具有明显的影响。
为了减少高温的影响,可分次进行微波辐射,冷却至室温后再次进行第二次微波提取。
经过提取的物料,可用另一种提取剂,在微波辐射下进行第二次提取从而取得第二种提取物。
(四)酶法:
选用适当的酶,通过酶反应较温和的将药物组织分解,达到提取、纯化有效成分的目的。
应用:
提取分离有效成分;结构分析;活性成分的确定。
(五)破碎提取法:
通过对材料在适当溶剂中充分破碎而达到提取的目的。
3、试述分离纯化动物药有效成分方法
一、系统溶剂分离法:
有效成分未知时可采用。
由亲脂性到亲水性,或由低极性到高极性的次序组成溶剂系统,依次提取药料粗粉中各种不同的成分。
二、两相溶剂萃取法:
利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。
•分配系数:
指在一定温度和压力条件下达到平衡时,物质在两种相互接触不相溶的溶剂中的浓度的比值。
•分配系数=在A液中的浓度溶解度/在B液中的溶解度
•成分复杂的中药:
采用极性由低至高的溶剂依次进行萃取已知成分。
(1)简单萃取法
1)仪器:
分液漏斗
2)缺点:
易发生乳化现象,需多次萃取。
(2)连续萃取法
1)仪器:
连续萃取器
2)优点:
简单且可避免乳化,溶剂用量不多而萃取效率高。
(3)液滴逆流分配法
仪器:
液滴逆流分配仪
三、沉淀法
(1)铅盐法脱铅方法:
H2S法;中性硫酸盐法(不彻底);大孔吸附树脂法。
(2)有机溶剂沉淀:
乙醇、丙酮。
(3)酸碱沉淀法
四、透析与超滤
(1)透析:
一种分离纯化技术,利用半透膜原理,将大分子物质与小分子物质分离开。
(2)常用半透膜:
硫酸纸膜、玻璃纸膜、大棉胶膜、动物性膜。
(3)微透析技术特点
1)时间分辨性
2)空间分辨性
3)提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物
4)样品不经预处理直接用于预测
(5)微透析样品的分析方法(在线分析)
1)微透析-高效液相色谱在线分析:
适用于检测离子强度高的样品。
2)微透析-高效毛细管电泳在线分析:
适用于检测离子强度低的样品。
五、盐析法:
在中药提取液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。
常作盐析的无机盐:
氯化钠,硫酸钠,硫酸镁,硫酸氨。
六、分馏法:
对于完全能够互溶的液体系统,可利用各成分沸点的不同而采用分馏法。
七、结晶法:
是分离和精制固体成分的重要方法之一,指利用混合物中各成分在溶剂中溶解度不同来达到分离的方法。
(1)前提:
结晶法所用的样品必须是已经用其他方法提得比较纯的时候才能采用此法精制。
(2)对结晶溶剂的要求
1)欲结晶物质在较高温度时的溶解度比低温下大3倍以上;
2)杂质与结晶物在溶剂中溶解度相差较大;
3)沸点在30-150℃;
4)结晶物在沸点不溶解,与溶剂不发生化学反应;
5)无剧毒,能形成良好结晶。
(3)操作:
加热溶解形成饱和溶液→低温放置结晶,也可分步结晶、重结晶。
八、色谱法应用:
分离混合物、精制化合物、鉴定化合物
九、电泳法
4、实验室中常用的层析技术的种类及原理
(1)吸附层析:
物质沿洗脱液的前进方向移动,经过反复的吸附、解吸附的过程,由于吸附剂对该物质的吸附能力的不同,物质的移动速度出现差异。
•吸附柱层析(用于分离)
•吸附薄层层析(用于鉴定)
基本操作:
薄层涂布;点样;展开(上行);显层(试剂显色定位)
(2)凝胶层析:
当样品流经固定相凝胶时,不同分子大小的各组分进入网孔受阻滞程度不同,以不同速度通过层析柱,从而分离。
•凝胶种类:
葡聚糖凝胶、琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
•应用:
分离纯化物质、脱盐、分子量测定等。
(3)离子交换层析:
利用离子交换剂对各种离子有不同亲和力,来分离混合物中各种离子。
•固定相:
离子交换剂
•流动相:
具有一定pH值和一定离子强度的电解溶液。
(4)络合色谱:
利用被分离组分与络合剂或整合剂在色谱柱前或柱内形成整合物的稳定性不同或与流动相、固定相作用力不同,因而分配系数不同,使组分分离。
•一般用于分离金属或金属离子
(5)亲和层析:
以共价键将具有生物活性的配位体结合到不溶性固体支持物或基质上作固定相,利用蛋白质或大分子与配位体之间特异的亲和力进行分离。
•主要用于蛋白质和各种生物活性物质的分离、纯化。
5、制备型薄层层析与普通薄层层析有何区别
制备型薄层层析
普通薄层层析
样品浓度
5%-10%
较低
薄层厚度
0.5-1mm
200-250μm
点样方式
虚线或实线
点状
显层
部分显层
完全显层
洗脱
洗脱
不洗脱
6、层析技术的分类
(1)按两相物理状态分类(流动相)
(2)按固定相分类
(3)按分离过程物理化学原理分类
1)吸附色谱
2)
分配色谱
3)离子交换色谱
4)离子对色谱
5)凝胶色谱
6)络合色谱
7)亲和色谱
7、在薄层层析中,影响Rf值的因素有哪些
(1)温度
(2)薄层的厚度
(3)展开时间和展开距离
(4)层析箱中溶剂蒸汽的饱和度
(5)边缘效应
8、选取材料应注意哪几个方面
(1)生物的品种与部位
(2)生物材料的来源
(3)动物的生长期
(4)动物营养状况
(5)季节
(6)环境
9、实验室中采用哪些方法破碎生物材料
(1)机械法:
通过机械切力的作用使组织细胞破碎。
常用仪器:
高速组织捣碎机、匀浆器、研钵、粉碎机
(2)物理法:
通过各种物理因素使组织细胞破碎。
常用方法:
渗透压差法、加压破碎法、反复冻融法、超声波破碎法、冷热交替法
(3)生物化学法:
应用化学试剂改变细胞膜的通透性,破坏蛋白质和脂类的结合,达到破碎细胞的目的。
常用方法:
酶法(外源酶法和自溶法);表面活性剂处理法;有机溶剂法
第二章蛋白质
1、在蛋白质的提取过程中,应控制哪些因素提高蛋白质的提取率并防止变形
(1)溶剂pH值:
抽提液pH值应在偏离等电点的稳定范围内;
(2)溶剂离子强度和极性:
盐浓度应控制在0.02-0.5mol/L范围内;
(3)温度:
宜控制在0-10℃;
(4)提取液体积:
提取液和抽提物的比例要适当,一般以3-5倍为宜;
(5)添加保护剂。
2、试述蛋白质的分离纯化方法
一、利用溶解度的不同
1)盐析法:
用于盐析的中性盐通常有硫酸铵(最佳)、硫酸钠和硫酸镁等。
2)等电点沉淀法:
在加酸或加碱调节pH值的过程中,要一边搅拌一边慢慢加进,以防止局部过酸或过碱。
3)有机溶剂沉淀法
•缺点:
易引起蛋白质变性。
•要求:
把所有的机溶剂预冷到-10℃,整个操作在低温下进行,并且沉淀析出后要尽快分离。
4)聚乙二醇沉淀法
优点:
沉淀的条件温和,不易引起蛋白质变性,而且沉淀较完全,应用范围广。
二、利用分子大小和形状的不同
1)透析和超滤
2)密度梯度离心:
根据分子量和密度的大小不同进行分离的。
常用的梯度介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖。
离心采用水平转头高速进行。
3)凝胶层析
三、利用电离性质的不同
(1)离子交换层析
1)洗脱原则:
第一种是制作pH梯度;第二种是改变缓冲液的离子强度
2)洗脱方式:
阶梯洗脱;梯度洗脱
(2)聚焦层析:
以等电点的差异和离子交换行为作为依据。
•固定相:
多缓冲交换剂
•流动相:
多缓冲剂
(3)制备电泳
四、利用吸附能力的不同:
吸附力强移得慢。
五、利用生物功能的专一性
3、试述蛋白质的纯度鉴定方法
(1)电泳法
•显微电泳
•区带电泳(应用广)
1)琼脂和琼脂糖凝胶电泳:
电泳速度快,区带整齐,分辨率高,重复性好。
2)聚丙烯酰胶凝胶电泳(PAGE电泳):
样品用量少,分辨率高,可进行双向电泳。
3)SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE):
根据是蛋白质分子量的不同,用于判定分子量大小的均一性。
4)浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳:
用于测定天然蛋白质的分子量。
5)印迹转移电泳:
通过凝胶电泳将分离的蛋白质,再次经过电泳转移到固相载体表面的过程。
6)聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦:
用于测定蛋白质的等电点。
7)双向聚丙烯酰胺凝胶电泳:
第一和第二两向的电泳相互垂直。
8)毛细管电泳
(2)免疫法:
检测混合物中抗原或抗体的组分及含量,特异性、分辨率高。
1)免疫扩散:
根据抗原和抗体在琼脂介质中扩散,并产生沉流反应的一种方法。
2)免疫电泳:
微量免疫电泳、火箭免疫电泳(单向定量免疫电泳)、交叉电泳(双向)、亲和免疫电泳。
3)酶联免疫吸附(ELISA):
间接法、双抗原夹心法、竞争法、双抗体夹心法
4)免疫印迹:
斑点杂交、原位杂交、Westernblot
(3)分光光度法:
蛋白质浓度(mg/ml)=F×OD280×D/d
(4)高效液相层析法:
高效凝胶液相层析、高效离子交换液相层析、高效亲和液相层析、高效聚焦液相层析、反相高效液相层析
(5)超速离心法
第三章生物碱
1、生物碱
(1)性状:
多数为无色结晶形固体,少数为无定形粉末;多数具有苦味;液体状及个别固定具挥发性。
(2)通常左旋体生理活性强于右旋体。
2、生物碱的分类
(1)按碱性:
强碱性生物碱、中等碱性生物碱、弱碱性生物碱、酸碱两性生物碱
前三者可与酸形成生物碱盐,生物碱盐易溶于水,可溶于甲醇或乙醇。
(2)按溶解性:
亲脂性生物碱、水溶性生物碱
3、生物碱单体的分离方法
(1)利用生物碱碱性的差异(pH梯度法)
(2)利用生物碱或生物碱盐溶解度的差异
•无机酸生物碱盐溶解度>有机酸生物碱盐溶解度
•含氧酸生物碱盐>卤代酸生物碱盐
•小分子有机酸生物碱盐>大分子有机酸生物碱盐
(3)利用生物碱特殊官能团的性质
(4)利用色谱法进行分离
•吸附色谱法(脂溶性)、离子交换色谱法(水溶性)
•吸附剂:
硅胶、氯化铝、纤维素、聚酰胺
•流动相:
苯、氯仿、乙醚
4、水溶性生物碱的分离方法
(1)沉淀法
(2)有机溶剂萃取法
(3)离子交换树脂法
第四章甙类(苷类)
1、甙类的定义及分类
(1)按甙键原子:
氧甙、硫甙、氮甙、碳甙
(2)按甙元的化学结构:
氰甙,葸醌甙,黄酮甙,木脂素甙,醇甙,酚甙,酯氰甙,吲哚甙等
(3)按甙类在机体内的存在状况:
原生甙、次生甙
(4)其他
1)按照糖的名称:
葡萄糖甙、鼠李糖甙、木糖甙
2)按照连接单糖基的数目:
单糖甙、双糖甙、叁糖甙
3)按照连接的糖链数目:
单糖链甙、双糖链甙
4)按照甙类的来源:
人参皂甙、海参皂甙、三七皂甙
5)按照具有特殊的理化性质或生理活性:
皂甙类、强心甙类
2、皂甙的提取、分离与精制
(1)提取:
醇提取-正丁醇萃取法、甲醇/乙醇提取-丙酮/乙醚沉淀法、水提取法
(2)分离与精制:
分段沉淀法、铅盐沉淀法、胆甾醇沉淀法、氧化镁吸附法、色谱分离法
3、皂甙的生物活性:
溶血和鱼毒、杀虫和驱虫、对卵子及精子的抑制、抗生、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒作用。
第五章多糖
1、多糖的结构与其生物活性的关系
(1)一级结构:
多糖的糖组成和糖苷键类型的影响,多糖中的官能团对其生物活性的影响。
(2)高级结构:
多糖的特定空间构像是其产生生物学活性所必需的,对功能的影响比一级结构重要。
2、多糖的理化特性与其生物活性的关系
(1)溶解度:
多糖溶于水是多糖发挥生物活性的首要条件。
提高溶解度的措施:
降低分子质量、引入支链、对支链进行修饰(改造官能团)
(2)分子量:
分子量大小是多糖具备生物活性的必要条件。
(3)粘度降低粘度的措施:
引入支链(破坏次级键)、降解主链(使分子链减小)
(4)电荷密度:
电荷密度降低会使多糖的某些活性下降。
3、多糖的生物功能:
降血脂、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老作用。
4、多糖的提取方法
(1)水溶液提取法
溶剂:
水、稀酸、稀碱
方法:
渍浸法、渗滤法、回流提取法
(2)新方法:
酶法、微波提取法、超声波提取法、超声波酶提取法
5、多糖的分离方法
(1)分步沉淀法
(2)季铵盐沉淀法
(3)特异性沉淀法
(4)盐析法
(5)超滤法
(6)色谱法:
凝胶层析、离子交换层析
第六章萜类及挥发油
1、斑蝥素的定性、定量分析方法
(1)提取分离:
热水提取,氯仿萃取
(2)定性分析
1)镜检法(物理法),看晶型:
丙酮(棱柱形)、氯仿(针形)、乙醇(糠片状)
2)显色法(化学法)
•与对二甲氨基苯甲醛的反应:
红棕色或棕色
•与间苯二酚的显色反应:
溶液变为黄色
(3)定量分析
2、斑蝥素、角鲨烯、类胡萝卜素的生理活性及其抗癌作用机理
一、斑蝥素
(1)生理活性
1)抗癌
2)杀虫剂作用
3)抗病毒及抗真菌
4)对皮肤及粘膜作用
(2)抗癌作用机理
1)诱导肿瘤细胞凋亡
2)降低癌素激素水平
3)增强机体的免疫功能
4)刺激骨髓细胞DNA的合成
5)抑制癌细胞DNA及蛋白质的合成
6)促进白细胞从骨髓释放入循环池
二、角鲨烯
(1)生理活性
1)抗癌
2)强壮
3)抗菌
4)对皮肤的作用
5)增强机体免疫力
6)降血脂及软化血管
(2)抗癌机理
1)增强机体免疫力
2)抑制肿瘤细胞的生长
3)抑制致癌物质亚硝胺的生成
三、类胡萝卜素
(1)生理活性
1)抗癌
2)抗氧化
3)是维生素A原
4)增强机体的免疫技能
5)在动物生产中的应用
(2)抗癌机理
1)转移辐射能
2)增强机体的免疫力
3)致肿瘤细胞分裂
4)保护细胞免受光损害
5)增强细胞间的信息传递
6)刺激外周血白细胞释放细胞分裂素
3、挥发油的提取方法:
溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法、超声波-水蒸气蒸馏提取、压榨法、针刺法、吸收法、破碎法。
4、挥发油的分离纯化方法:
分馏法、色谱分离法、化学分离法
5、
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