水中退伍军人菌检测方法.docx
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水中退伍军人菌检测方法
水中退伍軍人菌檢測方法
NIEAW238.50C
一、方法概要
水樣經濃縮及酸處理後,塗抹於活性碳酵母萃取物選擇性培養基(Bufferedcharcoalyeastextractagarwithselectivesupplements,BCYEwithselectivesupplements),在二氧化碳培養箱,36±1℃,培養5±2天,疑似退伍軍人菌(Legionellaspp.)的菌落,應進行半胱氨酸需求試驗(L-cysteinerequirementtest)、革蘭氏染色(Gramstain)及直接螢光抗體染色試驗(Directimmunofluorescentantibodytest,DFA)或乳膠凝集試驗(Latexagglutinationtest)確認。
凡生長於含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基(BCYE),但不生長於不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基(BCYEwithoutL-cysteine)之菌落,革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌,無莢膜、不產孢子、短胖型或長絲型,及直接螢光抗體檢驗或乳膠凝集試驗呈陽性反應者,即判定為退伍軍人菌陽性菌落。
二、適用範圍
(一)本方法適用飲用水水質、飲用水之水源水質及水塔冷卻水中退伍軍人菌之檢驗。
(二)生物安全等級二級以上之實驗室才能進行本方法之檢測。
三、干擾
(一)水樣中含有抑制或促進退伍軍人菌生長之物質(如水樣中含有消毒劑或營養源會抑制或促進生長)。
(二)檢測使用的器皿及設備含有抑制或促進退伍軍人菌生長的物質(如器皿及設備含有清潔劑或營養源會抑制或促進生長)。
(三)濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞,將影響水樣的濃縮效率,進而影響檢測結果。
(四)雜菌過多將遮蔽或抑制退伍軍人菌之生長。
四、設備與材料
(一)量筒:
100至1000mL之量筒。
(二)吸管:
有0.1mL刻度之10mL滅菌玻璃吸管或市售無菌塑膠吸管,或無菌微量吸管(micropipet)。
(三)試管:
大小約150×15mm之試管或有蓋螺旋試管。
(四)稀釋瓶:
容量約100mL可滅菌之硼矽玻璃製品。
(五)錐形瓶:
200至2000mL之可滅菌硼矽玻璃製品。
(六)採樣容器:
容量500mL以上無菌之硼矽玻璃瓶或無菌塑膠有蓋容器,或市售無菌袋。
(七)冰箱:
溫度能保持在4±2℃者。
(八)培養皿:
可滅菌硼矽玻璃製或可拋棄式無菌塑膠製培養皿,大小為90~100×15mm或其他適當大小。
(九)過濾裝置:
能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗,以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。
(十)抽氣幫浦:
水壓式或吸氣式,壓力差最好在138至207kPa者。
(十一)濾膜:
直徑47mm,孔徑0.22μm的無菌聚碳酸濾膜(polycarbonatemembrane)。
(十二)天平:
待測物重量大於2g時,須能精秤至0.01g;待測物重量不大於2g時,須能精秤至0.001g。
(十三)二氧化碳培養箱(CO2培養箱):
能提供2.5~5.0%CO2,溫度能保持在36±1℃者。
(十四)高壓滅菌釜:
溫度能維持在121℃(壓力約15lb/in2或1.1Kg/cm2)滅菌15分鐘以上者。
(十五)高溫乾熱烘箱:
如用於玻璃器皿等用具之滅菌,溫度須能保持在160℃達2小時或170℃達1小時以上者。
(十六)加熱板:
可調溫度,並附磁石攪拌功能。
(十七)鑷子:
前端平滑、內側無波紋,使用前浸泡於95%酒精再以火燄燃燒滅菌。
(十八)接種環:
為白金或鎳鉻合金製,適用於細菌接種或移植,亦可使用無菌塑膠製品。
(十九)水浴槽:
溫度能保持在約50℃者。
(二十)第二級生物安全櫃(ClassⅡBSC)。
(二十一)pH計:
pH計之精密度必須達到0.1pH單位。
用於內含瓊脂培養基之pH值測定時,應搭配表面電極(surfaceprobe)。
(二十二)解剖顯微鏡:
能放大10~20倍。
(二十三)光學顯微鏡:
能放大至1000倍油鏡。
(二十四)螢光顯微鏡:
能放大至1000倍。
(二十五)紫外光燈:
波長365nm。
(二十六)試管震盪器(Vortexmixer)。
(二十七)馬克法藍氏濁度標準計(McFarlandnephelometerstandardunits)。
(二十八)玻片及蓋玻片:
光學染色及螢光染色專用兩種。
(二十九)乳膠或PVC手套。
(三 十)離心機:
轉速可達3000g,30分鐘以上,能控制溫度在4±2℃者。
(三十一)離心管:
10~50mL,具螺紋蓋為佳。
五、試劑
(一)試劑水:
蒸餾水或去離子水,導電度在25℃時小於2μmho/cm(μS/cm)。
(二)0.2MHCl:
配製方法可任選下列任一種方式(用於配製HCl-KCl酸性緩衝液)
1、取17.4mL35.4%濃鹽酸(試藥級)(比重1.18),加試劑水至1L。
2、取20.0mL31.5%濃鹽酸(試藥級)(比重1.16),加試劑水至1L。
(三)0.2MKCl:
(用於配製HCl-KCl酸性緩衝液)
秤取14.92gKCl(試藥級),先溶於少量試劑水中,俟完全溶解後,再加試劑水至全量為1L。
(四)1NHCl:
配製方法可任選下列任一種方式(用於調整培養基之pH值)
1、取8.8mL35.4%濃鹽酸(試藥級)(比重1.18),加試劑水至100mL。
2、取10.0mL31.5%濃鹽酸(試藥級)(比重1.16),加試劑水至100mL。
(五)1NKOH:
(用於調整培養基之pH值)
秤取5.6gKOH(試藥級),先溶於少量試劑水中,俟完全溶解後,再加試劑水至全量為100mL。
(六)1倍磷酸鹽緩衝液:
(用於直接螢光抗體檢驗)
磷酸二氫鉀(KH2PO4)(試藥級)2g
氯化鉀(KCl)(試藥級)2g
氯化鈉(NaCl)(試藥級)80g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(試藥級)11.5g
配製方法:
將以上成分混合,先溶於少量試劑水中,俟完全溶解後,再加試劑水至全量為1L。
(七)1%甲醛(福馬林):
(用於直接螢光抗體檢驗)
取2.67mL37.5%福馬林(試藥級),加1倍磷酸鹽緩衝液至100mL。
(八)3%硫代硫酸鈉:
取3g無水硫代硫酸鈉(試藥級),先溶於少量試劑水中,俟完全溶解後,再加試劑水至全量為100mL。
(九)培養基
1、活性碳酵母萃取物培養基:
由下列I、II、III等成份配製而成(用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗、菌株純化及次培養)
I 基礎活性碳酵母萃取物培養基(BCYEagarbase)(市售商品化培養基)
酵母萃取物(Yeastextract)10.0g
活性碳(Activatedcharcoal)2.0g
α-酮戊二酸(Alpha-ketoglutarate)1.0g
乙醯胺基-2-氨基乙磺酸(ACES)10.0g
(N-2-acetamido-2-aminoethanesulfonicacid)
焦磷酸鐵(Ferricpyrophosphate)0.25g
瓊脂(Agar)15.0g
II 氫氧化鉀(KOH)(試藥級)2.4g
III 半胱氨酸(L-cysteine)(試藥級)0.4g
配製方法:
秤取BCYEagarbase38.25g溶於500mL的試劑水中,秤取氫氧化鉀2.4g溶於490mL的試劑水中,混合兩者,俟完全溶解後,以121℃滅菌15分鐘,冷卻至約50℃備用。
秤取半胱氨酸0.4g溶於10mL的試劑水中,俟完全溶解後,以0.22µm或0.45µm濾膜過濾除菌。
兩者充份混合後,以1NHCl或1NKOH調整pH值,先倒出小部份培養基,待凝固後以表面電極測定,培養基最終pH值應為6.9±0.1。
倒入約20mL之培養基於無菌培養皿中,室溫下凝固。
未用完之培養基可保存於冰箱中,4±2℃下保存期限為30天。
2、不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基:
由下列I、II等成份配製而成(用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗)
I 基礎活性碳酵母萃取物培養基(市售商品化培養基)
酵母萃取物10.0g
活性碳2.0g
α-酮戊二酸1.0g
乙醯胺基-2-氨基乙磺酸10.0g
焦磷酸鐵0.25g
瓊脂15.0g
II氫氧化鉀(試藥級)2.4g
配製方法:
秤取BCYEagarbase38.25g溶於500mL的試劑水中,秤取氫氧化鉀2.4g溶於500mL的試劑水中,混合兩者,俟完全溶解後,以121℃滅菌15分鐘,冷卻至約50℃,以1NHCl或1NKOH調整pH值,先倒出小部份培養基,待凝固後以表面電極測定,培養基最終pH值應為6.9±0.1。
倒入約20mL之培養基於無菌培養皿中,室溫下凝固。
未用完之培養基可保存於冰箱中,4±2℃下保存期限為30天。
本培養基可以血液瓊脂培養基(Bloodagar)替代。
3、血液瓊脂培養基(Bloodagar)(市售商品化培養基):
即胰蛋白大豆瓊脂培養基(Trypticsoyagar)添加5%馬或綿羊血(Horseorsheepblood):
(用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗)
胰化蛋白腖(Tryptone)15.0g
大豆蛋白腖(Soytone)或硫化蛋白腖(Thiopeptone)5.0g
氯化鈉(NaCl)5.0g
瓊脂(Agar)15.0g
蒸餾水(Distilledwater)加至950mL
馬或綿羊血(Horseorsheepblood)50mL
配製方法:
秤取培養基40g,溶於950mL的試劑水中,經121℃滅菌15分鐘後,冷卻至約50℃,在無菌環境下加入50mL馬或綿羊血,充分混合後,倒入約20mL之培養基於無菌培養皿中,室溫下凝固。
未用完之培養基可保存於冰箱中,4±2℃下保存期限為30天。
4、活性碳酵母萃取物選擇性培養基:
可選用以下選擇性培養基任一種。
(1)DGVP選擇性培養基:
由下列I、II、III、IV等成份配製而成(BCYEwithDye,Glycine,Vancomycin,PolymyxinB)(用於篩選水樣中之退伍軍人菌)
I基礎活性碳酵母萃取物培養基(市售商品化培養基)
酵母萃取物10.0g
活性碳2.0g
α-酮戊二酸1.0g
乙醯胺基-2-氨基乙磺酸10.0g
焦磷酸鐵0.25g
瓊脂15.0g
II 氫氧化鉀(試藥級)2.4g
III 半胱氨酸(試藥級)0.4g
IV DGVP染料及抗生素添加劑(市售商品化抗生素添加劑)
Glycine3.0g
Vancomycin1mg
PolymycinB50000IU
Bromocresolpurple10mg
Bromoth
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