N端和C端结构域对于P2X的组装是非必要的.docx
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N端和C端结构域对于P2X的组装是非必要的
N端和C端结构域在P2X内的组装是分散的
单克隆抗体免疫共沉淀(抗FLAG,抗HA)的非离子洗涤剂过去也被用作为探针,通过考察P2X2缺失突变体和嵌合能力与在HEK293细胞全长P2X2和P2X3亚基的关联来探查在HEK293细胞中P2X2受体装配[100]。
免疫共沉淀显示无论是胞内功能区的N端还是C端结构域(直到28rP2X2残基和362rP2X2远端残基,分别对应30zfP2X4和370zfP2X4)都不是全长rP2X2或rP2X3亚基细胞表面表达和组装所必需的。
此外,通过α7nAChR信号肽裂解置换rP2X2残基1-50(包括整个TM1螺旋)并没有阻止全长rP2X2或rP2X3亚基的免疫共沉淀,这些数据在很大程度上排除了胞质内N端或C端结构域或TM1螺旋在亚基识别方面的序列特异性作用。
[100]
BN-PAGE直接显示了胞内C端结构域的三聚体的分散性,表明了hP2X5结构可以控制exon-10residues(hP2X5+exon10)的插入,但是缺乏整个细胞内C端结构域(residuesR365hP2X5+exon10onwards)也可以和同源三聚体一样高效率的组装。
[101]这三种基本残基覆盖在突变体胞内C端结构域的最末端。
363KKR365hP2X5+exon10(对应着365KKR367zfP2X4)最有可能作为符合“正电荷居内规则”的拓扑基因的信号[102]。
由截去ΔzfP2X4结构(residues27-381zfP2X4对应25-379hP2X5+exon10)的N端和C端结构域组成的同源三聚体晶体结构证实了N端结构域和至少一部分C端结构域的组装是有分散性的。
TM2通过限制胞外结构域的折叠空间影响组装
通过观察截去了R304rP2X2(对应着R312zfP2X4orR310rP2X5见图5A5A)并且删除了pre-TM2
区(相当于βstrand14ofthezfP2X4结构)可以推断出TM2螺旋在同源和杂合三聚体中扮演着重要角色,并且TM2螺旋阻止了全长P2X2或P2X3亚基的组装以及自我的组装[100]。
这种观点是通过两嵌合体组成的胞外段两侧的包括rp2x3跨膜螺旋(x3-x1-x3),反之亦然(x1-x3-x1)的P2X1N-和C-末端结构域的免疫共沉淀实验进一步支持[100]。
在HEK293细胞中,理由是WTP2X6可以装配rp2x1但不与rp2x3共表达[103]。
有趣的是,x1-x3-x1嵌合体可以与WTrp2x6亚基共沉淀,而x3-x1-x3和WTP2X3不行[100,103]。
这一发现被解释为支持一个观点,TM螺旋怀有对P2X亚基组装很关键的特异识别基序。
为了研究在P2X亚基组装中TM2螺旋的作用,我们利用WTP2X5亚基发生在人类仅仅作为一种缺乏pre-tm2区和大部分的TM2螺旋由于剪接10外显子跳跃自然缺失突变体的事实(图5A5A)指定为hP2X5Δ328-349,而hp2x5Δ328-349不作为一个功能性的ATP门控离子通道表达。
WTrp2x5cDNA,其中包括exon-10密码子,导致典型的P2X受体介导的电流表达[104]。
通过BN-PAGE,我们可以证明,全长rp2x5亚基高效的组装为三聚体,而exon-10-lackinghp2x5只形成高阶的聚集体,完全保留在内质网[101]。
尽管这些研究结果证实,TM2螺旋对P2X亚基的高效组装是绝对必须的,但是认为TM2螺旋能够提供特定亚基识别信息[100]原来是站不住脚的,至少对于P2X5亚基来说。
结果的发生是因为由于广泛的丙氨酸和亮氨酸的块替换使TM2螺旋通道功能受损,但是分别通过限制性蛋白水解与BN-PAGE显示扰乱折叠或者三聚体均不能做为探针。
在exon-10-lackinghp2x5亚基的情况下(hp2x5Δ328-349)丙氨酸拉伸的足够长,排除了疏水性不匹配,而是被迫通过剪接跳过一半的TM2螺旋激活组装的同源三聚体和跨膜段的形成[101]。
总之,这些发现与全长TM2螺旋对同源三聚体的作用是作为二膜锚的支架的观点完全契合[101]。
通过C端结构域的末端与细胞膜的链接,TM1和TM2之间形成了一环状结构,限制了胞外结构的空间移动,并且因此限制了折叠空间。
这种结构可以通过识别细胞表面帮助正确定位以及允许更高效的碰撞发生,从而防止相邻型之间的聚集来协助组装。
所有第二跨膜结构域的形成的序列操作,包括包括在hp2x5外显子10缺失(图5a5a)也会造成严重的亚基聚合。
关于同源亚基与亚基之间相互作用的特定信息必须位于胞外段[101]的研究的结论通过zfp2x4晶体结构被支持。
表明亚基间的联系主要由胞外区提供[1,2]。
三种TM1螺旋在三种TM2螺旋的外面,这种结构形成了线性排列的中心离子通道[2]。
在TM2螺旋内(在Leu340zfP2X4,Leu346zfP2X4andAla347zfP2X4之间)有一些膜内连接,用于稳定关闭的通道。
在ATP结合的反应中,当TM螺旋从中央轴移动到开放的通道时,这些膜内连接便破裂了。
因此,尽管出现了明显的差异,但是同时,新的稳定开放通道的亚单位链接(包括Leu346zfP2X4andIle355zfP2X4)也形成了。
D355rP2X5,由拓扑算法预测属于TM2螺旋,是唯一确定支持hp2x5亚基同源三聚体相关程度的的热点残基[101]。
D355rP2X5通过穿过所有7种P2X受体亚型被保护起来。
我们认为它是一个有趣的候选,作为组装的中介,在TM1螺旋的末端残基驱动二聚体或者三聚体形成的过程中[105,106]。
然而根据zfP2X4受体的晶体结构,相应的D357zfP2X4残基应局限在TM2螺旋末端内侧(图5B5B)。
在这个位置上,相比于亚基的组装,通过其带负电荷的链身与脂质头部基团相互作用在TM2螺旋与细胞膜之间发挥更好的作用。
TM螺旋在P2X受体功能性上的相互作用
虽然事实上形成成熟的同源三聚体结构并不需要特定序列TM2之间的相互作用,但是不能够排除TM螺旋作为ATP门控通道对P2X受体的功能起着重要的作用。
的确,有证据通过洗涤剂表明通过zfP2X4受体结构能够使包装松散的TM螺旋显露出来,这些洗涤剂总是优先占据体积较大,围绕大的水溶性膜蛋白的疏水区域[107]。
支持这一观点的证据来自观察:
在zfP2X4结构中的高度倾斜缠绕的TM螺旋会导致极薄的疏水层的形成(<20Å),这些疏水层太薄以至于无法跨过原生膜。
Thesuggestionthattheintermonomerfenestrationsseeninthestructureleavethechannelporeopentothefattyacylenvironment[107]couldbedemonstratedbyamoleculardynamicssimulationofthemembrane-embeddedzfP2X4。
相对温和的TM螺旋结构重排,足以提高疏水性的不匹配,并且通过TM螺旋更紧密的组装导致在膜之间形成了一个内界面[108]。
以下的两个界面是确定的:
(i)TM残基L351rP2X2,一个亚基的I355rP2X和W358rP2X2与相邻TM2螺旋上的L346rP2X2,A347rP2X2和V354rP2X2相互作用。
(ii)TM1残基Y45rP2X2和相邻TM2亚基的L340rP2X2相互作用[108]。
大量关于在打开状态的膜内嵌入受体内的紧缩TM螺旋包装的计算和实验证据也能从在每个独特的亚单位中rP2X2受体内的S345CrP2X2,C348rP2X2(TM2)和H/C33rP2X2(TM1)之间的金属桥梁的功能分析推断出来[108]。
ThecloseintrasubunitproximityofTM1andTM2wasalsoevidentfromdisulfidetrappingexperimentsofanH33C/S345CP2X2mutant【109】。
有趣的是,李和他的同事早在2010便提出了一个观点,即在关闭状态的zfP2X4结构中,在孔区亚单位与亚基之间的相互作用受闸区的限制,这表明在通道开放时孔隙增大,其他亚基亚基之间的链接可以稳定孔区结构,同时表明TM1残基H33与在开放孔区内的相邻的两个TM2上的残基S345相互作用[6]。
基于ZFP2X4晶体结构的测绘基础点
为了确定对zfP2X4亚基组装有潜在作用的连接斑块,我们可视化溶液可及的vanderWaals表面相互作用根据表面的疏水性和静电电位相互作用(图22)。
通过考虑相邻两个亚基之间的原子<4.5Å的vanderWaals表面区域,亚基与亚基之间的接触面在开放和关闭的状态下可以被可视化{图33)。
相邻亚基通过静电作用或通过氢键或疏水的特殊残基(范德华力)被列出在表11中。
图2
表面暴露的侧链与zfP2X4亚单位相互作用,显示的是在受体单个亚基上的表面暴露侧链在载脂蛋白封闭状态下的表现(leftpanel;PDBentry4DW0[2]),并且结合ATP开放了相邻两个zfP2X4亚基的接触面。
图3
表1
基于zfp2x4受体的晶体结构的亚基与亚基间相互作用位点的计算预测,在小于4.5Å的zfp2x4受体的晶体结构中通过应用该过滤器的标准计算的数据[224,225]。
ATP结合位点
在最近一些关于这个课题优秀的综述中提及了几位优秀的审稿人,同时包含广泛的背景信息[110-115]。
这些综述中包含了关于结合ATP的几个突变残基的特别全面的和有价值的表格概述[116]。
在预期集中在胞外结构域的晶体结构中尝试定位ATP结合位点,这些位点被保护在7种P2X受体的亚基中。
相应的残基突变为丙氨酸或者半胱氨酸,而且表达的突变体的电生理特点可以与ATP的动作电位相比。
这种方法确定了一系列的带正电荷的残基(通过上标来表明P2X的种类和亚基),例如K68hP2X1,K70hP2X1,R292hP2X1andK309hP2X1(对应K70zfP2X4,K72zfP2X4,R298zfP2X4andK316zfP2X4)(图44,5D5D),残基末端T186hP2X1andN290hP2X1(T189zfP2X4andN296zfP2X4)(图44,5D5D),芳香族残基F185hP2X1andF291hP2X1(F188zfP2X4andF297zfP2X4)和其他[34.117-132]。
实验证据表明,ATP结合位点(S)可以在两相邻亚基的界面产生氧化反应,通过半胱氨酸的亚单位交联键被残基取代,这个过程对于ATP高效的运作是必不可少的。
当rp2x1受体在非洲爪蟾卵母细胞表达时,在两个被代替的两个位于胞外结构域的半胱氨酸K68CrP2X1andF291CrP2X1(图5E5E)之间自发形成亚单位交联键[133]。
其他六对残基的半胱氨酸突变(K70rP2X1,F185rP2X1,K190rP2X1,R292rP2X1,R305rP2X1,andK309rP2X1)没有导致亚单位交联键形成。
图4
在zfp2x4亚单位受体激动剂结合位点内ATP的配位,在PDBentry4DW1[2]显示了在ATP复合体中开放状态下的zfP2X4受体结构的亚单位ATP结合区域,选择多肽主链的副链…
此外,在一个基于赖氨酸残基,与ATP的结合和位于附近的受体胞外段两端的丙氨酸替换的研究K69rP2X2andK308rP2X2以及K68rP2X3andK299rP2X3对rp2x2和rp2x3受体结合的ATP是必不可少的,得出的结论是,受体激动剂结合位点位于两相邻亚基的亚基之间的界面[129]。
最终确认这些代表ATP结合槽的亚单位槽由ATP结合的开放状态的zfp2x4受体的结晶提供[2]。
三磷酸链和ATP分子腺嘌呤环形成U形结构在ATP结合槽内。
ATP的磷酸氧化是由一条链上的K70zfP2X4andK72zfP2X4和相邻的另一条链上的N296zfP2X4,R298zfP2X4andK316zfP2X4相互配合的(图44)。
与半胱氨酸的巯基反应的ncs-atpP2X2受体突变体的一致性显示,L191zfP2X4(见图5F5F,与L186rP2X2相对应)与I232zfP2X4之间的疏水相互作用使ATP的腺嘌呤相互协调。
腺嘌呤基通过T189zfP2X4的侧链和主链上与K70zfP2X4主链的氢键使其更加稳定[2](图44)。
核糖通过L217zfP2X4疏水键相互作用部分分解被认为是唯一的[2]。
在不同受体不同亚基上的ATP结合位点的特殊序列最近通过同源建模被发现[134]。
突变数据的结构解释提供了关于ATP结合关键观点
E52-G96hP2X1胞外残基的半胱氨酸扫描诱变结合综合药理分析,通过巯基特异性试剂显示的[32P]2-azido-ATP交联键和半胱氨酸突变体确定K68hP2X1,K70hP2X1andF92hP2X1残基分别激活或抑制hP2X1受体通过受体激活剂和拮抗剂苏拉明[135]。
绘制E52hP2X1-G96hP2X1与hP2X1侧翼区的半胱氨酸扫描突变体模型的数据[127,128]和在硅分子上对接的ATP和BzATP提供的ATP结合位点的同源模型与实验数据一致[135]。
hP2X3丙氨酸突变体的功能分析确定了保守残基对ATP结合在hp2x3受体上很重要,包括基本残基K63hP2X3,K65hP2X3,K176hP2X3,K299hP2X3andR281hP2X3(图5D5D)残基末端G66hP2X3,N177hP2X3,N279hP2X3,andT172hP2X3和芳香烃残基F171hP2X3andF280hP2X3。
hP2X3受体上已知残基的同源模型的预测显示在ATP识别方面,残基在亚基界面上是以组的形式被聚集成一组残基,而不是单个残基[136]。
在使用8-thiocyano-atp(ncs-atp)衍生物与ATP分子的腺嘌呤环的位置8的巯基反应组的巧妙的研究中,P2X2受体的ATP结合位点被暴露出来[3]。
半胱氨酸在相邻两个亚基上被取代,并且分开~18Å(N140CrP2X2andL186CrP2X2;图.5F5F),这个现象说明通过NCS-ATP被共价标记了的被追踪的受体处在共价结合状态,并且通过栓系的位置,增强(L186CrP2X2)或减弱(L140CrP2X2)调节门控通道的能力。
这些结果表明在亚基界面的ATP结合位点在ATP上的定位受限于受体调节门控通道的概率[3]。
在随后的研究中NCS-ATP受限于L186CrP2X2产生的ATP结合位点构象的改变,但是不会改变通道的开放,这表明调控和预激活状态的存在指导P2X2受体的门控通道[137]。
关于P2X1受体的电压钳法研究用四甲基马来酰亚胺(TMRM)标记的半胱氨酸残基取代在位于C117rP2X1/C126rP2X1之间(图5G5G)的第一保守二硫桥之间的拉伸的残基,C117rP2X1/C126rP2X1定位在头域的基部,用于分析ATP的激活,门控通道和脱敏现象[10]。
通过同源模型和ATP对接的三维演示表明头域的基部对着ATP结合位点,ATP的核糖集团对着细胞液,解释了实验数据。
TMRM与经过设计的半胱氨酸残基共价链接表明了配体的结合(N120CrP2X1,E122CrP2X1,andG123CrP2X1),构象改变与通道开放的关联(G115CrP2X1andG124CrP2X1),和脱敏现象(P121CrP2X1andI125CrP2X1)[10]。
荧光ATP衍生的Alexa-647-ATP可以作为可视化配体结合和分离有效的工具。
P2X1受体的持久脱敏特点是缓慢释放拮抗剂和激动剂诱导的受体内在化[138]。
有趣的是,与巯基反应的荧光染料Alexa-Fluor546C5-maleimide一般ATP不敏感的K69CrP2X2突变体P2X2受体导致通道的门控(开放)对锌,酸性PH和缺乏ATP的情况做出反应[139],这可能使活化机理研究独立于ATP结合。
ATP结合位点的内在动力学影响ATP的结合和随后的变构变化
一项hP2X3受体的研究中利用在内部和亚单位区域之间的临近位置的分子动力学模拟及半胱氨酸氧化交联键的替换,例如头区和背部,背部和左侧。
它表明ATP结合位点会自发的发生构象改变,即使没有ATP[140]。
有趣的是,自发交联的K201ChP2X3(背部)和V274ChP2X3(左侧部)(图5H5H)能够阻止ATP结合在受体上,通过分析与ααβ-meATP均等的荧光ATP衍生物BODIPY-TRATP。
得出的结论是高构象的域构成的ATP结合槽是激活位点和活化受体的先决条件[140]。
此外,在zfp2x4受体中ATP的识别是通过头域的内在动力学测定[141]。
在左侧和背侧的因ATP产生和ATP缺乏的内在动力学改变引起的构象改变同样通过分子动力学和zfp2x4受体的简正波分析法显示出来,并且通过在左侧和背侧的动力锌桥以及半胱氨酸的交联被证实[142]。
开放P2X受体所需要的ATP分子
由克隆rp2x2受体介导ATPATP的浓度反应引起全细胞电流产生的希尔系数为2.0,表明激活位点需要一个以上的激动剂分子结合[20]。
从对rp2x2受体介导的电流单通道记录ATP的浓度依赖性估计一个类似的ATP激活的希尔系数是2.3[143]。
由此说明对于重要的配体结合位点的量化,希尔系数是不可靠的,即使在强大的正协同效应的情况下,希尔指数也只提供最低限度的结合位点数[144]。
因此,希尔系数为2.3表明在一个有活性的P2X2受体至少有三个ATP结合位点。
数据的动力学造模表明,结合位点是不独立的,只有在完全激动剂配体通道的时候才会开放,在缺乏ATP的情况下没有观察到通道的自发开放[143]。
突变的P2X受体同源-异源三聚体与动力学建模相结合提供了不同的观点。
通过示范每个P2X受体结合两个ATP分子对于门控通道是足够的[86,145-149]。
每个同源三聚体只有一个ATP结合位点的占位不能产生足够引起检测的内部电流,但是能产生未占位位点的ATP结合位点构象的改变[3,137,150]。
这种构象变化主要是促进了第二个和第三个ATP分子的结合表明了正协同作用的结构相关性在电生理学研究的早期被发现[143]。
此外,光亲和的荧光rp2x2-x1嵌合体和rp2x2受体和通过电压钳法的分析表明在随后的激动剂结合,预先激动剂表现出增加门控效率的现象[137,150,152]。
ATP构象改变可产生中间通道关闭状态。
嘧啶和二磷酸核苷酸类似物,如ADP,UTP和CTP在结合三个位点中的一个是有效的[150]。
通过同源对接和诱变显示竞争性拮抗剂的结合
hP2X1受体突变体K68AhP2X1andK309AhP2X1会导致ATP效力最大的减少,但不影响对抗作用[117]。
这些以及类似的hp2x1受体的芳香族氨基酸残基导致的结果引发的是否为ATP的结合位点和苏拉明结合的结合位点是不同的问题[120]。
DdP2X对常见的P2X受体阻滞剂苏拉明,PPADS和TNT-ATP治疗不敏感[34]。
ddp2x受体缺乏一个在哺乳动物的P2X受体发现的重要的部分,就是富含半胱氨酸的头域,在对NF449敏感的人P2X受体和对NF449不敏感的DdP2X受体之间的嵌合体和hp2x1和hp2x2突变体的药理分析显示集群中的正电荷残基(136KAKRKhP2X1)(图5I5I)有助于苏拉明和NF449灵敏度的提升[153]。
因为这些集群正电荷对于P2X2受体来说是缺乏的,这些数据为NF449的效力不足[153,154]以及P2X2受体的相关衍生物[155,157]似乎提供了合理的解释。
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