山东省临床检验实验室血培养操作指南试行.docx

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山东省临床检验实验室血培养操作指南试行

山东省临床检验实验室血培养操作指南（试行）

  二〇一一年五月三十日

目 录

   1.标本的采集和运送

   1.1总体要求

   1.1.1血培养的临床指征

   1.1.2血培养的采集时机

   1.1.3血培养的次数

   1.1.4血培养的采血量

   1.1.5血液标本在需氧瓶和厌氧瓶中的分配

   1.2血培养标本的采集

   1.2.1皮肤消毒与防止血培养污染

   1.2.2标本采集部位

   1.2.3减少血培养污染的注意事项

   1.3血培养标本的运送

   1.4血培养标本的拒收标准

   1.5培养瓶的选择

   1.6血培养的培养周期

   2.几种特殊要求的血培养

   2.1分枝杆菌血培养

   2.2婴幼儿血培养

   2.3导管相关的血流感染（CRBSI）

   2.3.1短期外周导管

   2.3.2中心静脉导管及静脉留置口（VAP）

   2.4感染性细菌性心内膜炎

   2.4.1血培养的采集时机

   2.4.2需要的血培养数量

   2.4.3需要的培养瓶

   2.4.4血培养所需孵育时间

   3.血培养结果的报告方式

   3.1阳性血培养的分级报告制度

   3.1.1初步报告

   3.1.2二级报告

   3.1.3最终（书面）报告

   3.2其他报告和记录

   4.血培养的污染问题及其鉴别

   5.血培养的质量控制

   5.1血培养分析前质量控制

   5.1.1病人评估

   5.1.2血培养标准操作规程（SOP）的制定和培训

   5.1.3样本采集

   5.1.4样本运送

   5.1.5样本接收和处理

   5.2血培养分析中质量控制

   5.3血培养分析后的质量控制

   5.3.1报告

   5.3.2记录管理

   5.3.3咨询

   参考文献 

   当微生物侵入血液迅速繁殖超出机体免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血症或真菌血症（统称血流感染），并可感染血管外组织,临床上应该进行急症处理,应尽快采集血液进行培养。

资料显示，菌血症或真菌血症发病率近10年来持续增加，2007年美国共报告菌血症发生66万例[1]，在各种感染中居首位，且死亡率高（20%~50%）。

血培养是采集患者血液标本并接种到培养瓶中，用以发现、识别引起菌血症或真菌血症的病原微生物，是诊断菌血症和真菌血症的基本而重要的方法。

血培养结果对感染性疾病的诊断、治疗和预后都有极为重要的临床意义。

   1.标本的采集和运送

   1.1总体要求

   1.1.1血培养的临床指征：

   患者出现以下一种或同时具备几种临床表现时可作为血培养的重要指征：

①发热（≥38℃）或低温（≤36℃），以间歇驰张型多见，革兰阴性杆菌，如大肠埃希菌引起的感染可见双峰热；②寒战；③白细胞增多（>10.0×109/L，特别是有“核左移”时）；④粒细胞减少（<1.0×109/L）；⑤血小板减少；⑥皮肤、黏膜出血，常见于溶血性链球菌感染的菌血症，伤寒病人第4~10天可出现玫瑰疹，斑疹伤寒第4~6天可出现暗红色斑丘血疹；⑦昏迷；⑧多器官衰竭；⑨血压降低；⑩呼吸加快（呼吸率>20/分或CO2分压<32mmHg）；以及肝脾肿大；关节疼痛；C反应蛋白、内毒素、降钙素原升高等。

   对新生儿可疑菌血症,还应同时做尿液和脑脊液培养。

   老年菌血症患者可能不发热或体温不低，如伴有身体不适、肌痛或卒中，可能是感染性心内膜炎的重要指征。

   1.1.2血培养的标本采集时机：

   只要怀疑患者有血流感染的可能，在考虑使用抗菌药物之前，都应立即采集血培养标本。

若患者已行抗菌药物治疗，则应选择含有抗菌药物吸附物的培养瓶，并在下一次抗菌药物应用前采血培养。

细菌通常在寒战和发烧前1小时入血，此时为采集血培养标本进行病原菌培养的最佳时机。

   1.1.3血培养的次数：

   要求：

对怀疑菌血症、真菌血症的成人患者，推荐同时或短时间间隔（10分钟内）从不同部位（如双臂）采集2～3套血培养标本，做到“双瓶双侧”。

如有必要，可同时或短时间间隔内从下肢静脉采血接种第三套培养瓶。

在采集血培养后的2至5天内，不需要重复采集血培养

   只有在疑似感染性心内膜炎或导管相关性感染患者的连续性菌血症时在不同时间点采血才有必要。

   婴幼儿患者，需要同时采集2次（不同部位）血培养标本。

   说明：

以一个需氧瓶和一个厌氧瓶为一套血培养，作为常规血培养组合。

所谓“双瓶双侧”，是指从一个部位采血接种一套培养瓶，再从另一部位采血接种另一套培养瓶。

一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单个血培养[2]

   研究表明[3]，只做1套血培养，病原菌的检出率仅为65%，两套血培养为80%，三套血培养为96%。

单瓶或单套血培养不仅检出率不高，而且难以区分污染导致的假阳性，结果很难做出临床解释，应该坚决予以废除。

   在抗菌药物治疗开始后的2至5天内，血液中的细菌不会立即清除。

一般菌血症或真菌血症的患者可通过临床表现来判断疗效，无需复查血培养或者连续监测血培养。

但有两个例外：

一是细菌性心内膜炎患者，对于其菌血症或真菌血症是否被清除，连续血培养可被用于评估和指导治疗；二是与感染性心内膜炎无关的金黄色葡萄球菌血症，对其阳性血培养的48至96小时追踪可以很好地预测复杂的金黄色葡萄球菌血症[5]。

   1.1.4血培养的采血量：

   要求：

成年患者推荐的采血量为20~30ml,每套不少于10ml，每瓶不少于5ml。

婴幼儿患者推荐的采血量应少于患儿总血容量的1%，每瓶不少于2ml。

对于采用成品血培养瓶的实验室，必须按照血培养瓶生产厂家的建议，采集足够的血液标本。

   说明：

血培养采血量是影响病原菌检出率的最重要的可变因素[3，4，6，7]。

一般情况下，成人菌血症患者外周血中细菌浓度为1~10CFU/ml，成人血培养采血量在2～30ml之间时，病原菌检出率与采血量成正比例增长[3，4，7]。

儿童患者同样有数据表明检出率与血培养的采血量成正相关[8]，但由于儿童患者血液中病原菌浓度较高，一般约为成人血流感染病原菌浓度的10倍，血培养标本量无需等同于成人。

但是，儿童也可能发生低水平的菌血症，血培养采血量要根据患儿的血容量和年龄确定。

   1.1.5血液标本在需氧瓶和厌氧瓶中的分配

   要求：

以一个需氧瓶和一个厌氧瓶为一套血培养，作为常规血培养的组合。

当采血量不够推荐的采血量时，应首先满足需氧瓶，剩余标本再接种入厌氧瓶。

   说明：

采用一个需氧瓶和一个厌氧瓶的血培养组合与采用2个需氧瓶的组合相比，可检出更多的葡萄球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌[9]。

真菌和严格的需氧菌（如假单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌）几乎全部只能从需氧瓶中分离到。

   1.2血培养标本的采集

   1.2.1皮肤消毒与防止血培养污染

   要求：

使用碘伏、碘酊、次氯酸或洗必泰作为血培养的皮肤消毒剂，碘酊的作用时间不能少于30秒，碘伏的作用时间则需要1.5～2分钟。

   说明：

碘酊与洗必泰的效果大体相当。

洗必泰的作用时间和碘酊一样，但是没有过敏反应，因此在静脉穿刺完成后不必擦去，但不能用于小于2个月的婴儿皮肤的消毒。

对年龄小于2个月的新生儿，需使用70%的异丙基乙醇进行皮肤消毒。

消毒剂需要有足够的作用时间以保证消毒效果。

   1.2.2标本采集部位

   要求：

从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。

必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。

   说明：

不建议采集动脉血，其诊断价值不高，且增加了抽血污染的机会。

尽量避免从静脉留置导管采血培养，因其常伴有高污染率［10，11，12]。

如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读（参见3.4导管相关血流感染）。

   1.2.3减少血培养污染的注意事项

   要求：

采血之前，血培养瓶的橡皮塞需使用70%异丙醇酒精消毒并干燥，然后再进行穿刺部位的皮肤消毒。

   严格按照1.2.1所述皮肤消毒方法操作，并等待足够消毒时间。

    严格无菌操作，不允许在皮肤消毒后用手接触待穿刺部位，除非带有无菌手套。

    不推荐采血后更换注射器针头接种血培养瓶，采用真空采血装置能降低污染率。

   说明：

无论采用何种采血方法，血培养可接受的污染率通常是≤3%［13]。

研究表明，经过专门培训的熟练抽血者采集血培养的污染率为3%，而未经培训的住院医生和护士污染率则达11%。

因此对临床护士就血培养标本采集进行专门的、严格的培训是非常必要的。

   1.3血培养标本的运送

   要求：

采血后应该立即送检。

如不能立即送检，需室温保存，切勿冷藏。

标本接种到培养瓶后,需轻轻颠倒混匀以防血液凝固。

   说明：

血培养瓶在接种前、接种后均不得冷藏或冷冻，否则会导致某些病原微生物死亡。

接种后的培养瓶最好立即送到实验室，最迟不能超过2小时。

自动化连续监测系统虽有允许延迟上机监测微生物生长的原理,还是应该尽量减少延迟上机时间，否则可能导致检测时间延长甚至假阴性结果。

   1.4血培养标本的拒收标准、

   遇到下列血培养标本应拒收并且要求重新采集标本：

   1.血培养瓶上贴的标签错误或未贴标签。

   2.血培养瓶渗漏、破裂或明显污染。

   3.血液凝固。

   1.5培养基的选择

   推荐使用商品化的血培养瓶。

   说明：

使用添加抗菌药物吸附剂（如树脂或活性碳颗粒）的血培养瓶有助于提高已接受抗菌药物治疗患者血培养的检出率，特别是能提高葡萄球菌和真菌的检出率[14]，但同时也会增加污染菌的检出。

   1.6血培养的培养周期

   要求：

传统手工血培养方法一般孵育7天。

自动化血培养系统的标准血培养周期为5天。

5天后阴性血培养标本无需常规进行转种。

   说明：

自动化血培养系统的标准血培养周期为5天，包括布鲁杆菌、流感嗜血杆菌、放线杆菌、心杆菌、侵蚀艾肯菌、金杆菌以及营养变异链球菌等的培养周期都是5天［15]。

对怀疑为感染性心内膜炎患者的血培养也不必延长培养时间。

有研究表明，自动化血培养系统一般能在3~4天内检出95%~97%的有临床价值的细菌和真菌，但目前仍然推荐5天的培养周期。

特殊情况可适当延长培养时间。

   2.几种特殊要求的血培养

   2.1分枝杆菌血培养

   要求：

必须用特殊的商品化分枝杆菌血培养瓶。

所有培养都必须孵育至少4周。

培养温度为25~30℃。

   说明：

虽然分枝杆菌并不需要特别复杂营养的微生物，但是为了更好地从血标本中分离出分枝杆菌，需要在肉汤培养基中补充脂肪酸（如油酸）、白蛋白和二氧化碳。

一些分枝杆菌菌种（如日内瓦分枝杆菌、嗜血分枝杆菌）还需要分枝菌素、血红素、血红蛋白或枸橼酸铁铵这样的添加剂。

   快速生长的分枝杆菌（如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、产粘液分枝杆菌等）所致菌血症则大多与长时间留置静脉导管污染有关[16]。

   2.2导管相关的血流感染（CRBSI）

   据估计，美国每年发生超过25万例的CRBSI，病死率达12~25%。

目前国内还没有相关的统计资料，但随着长期留置导管患者人数激增，CRBSI会越来越严重。

CRBSI发生的危险因素包括：

导管类型（中心静脉导管，外周导管）、导管放置时间及部位。

虽然CRBSI发生比较频繁，但目前还缺乏诊断CRBSI的金标准，诊断往往比较困难。

临床上在留置导管部位常常没有炎症表现，只有一些非特异的临床症状提示可能存在菌血症。

临床微生物实验室有一些诊断此类感染的方法，比如导管片段的定量、半定量培养；经外周静脉采血和经导管采血培养结果比对；经外周静脉采血和经导管采血定量培养，比较经外周静脉采血和经导管采血培养阳性报警时间的差异等[18]，但还没有明确的结论表明哪种方法最好。

为避免不必要的导管拆除，可以尝试导管保留在原位的CRBSI诊断方法。

正确地区分CRBSI与皮肤污染、微生物仅在导管上定植以及其他来源感染有重大临床价值。

   2.3.1短期外周导管

   要求：

通过静脉穿刺获得病人的两套外周血培养（双瓶双侧）。

无菌操作拔出导管并用Maki半定量方法[19]培养。

  说明：

Maki半定量法是先用75%酒精清洁导管周围皮肤，然后无菌移动导管，剪取导管末端5cm置于无菌容器中，立即送至实验室（为防止干燥，常规培养送检时间不得超过15min，4℃保存不得超过2小时）。

实验室人员用无菌镊子将导管在血琼脂平板上交叉滚动4次，然后弃之，将接种后的培养基置CO2孵箱35℃过夜培养，平板上菌落数不少于15个为阳性。

  培养结果的解释：

   a 如果一套或多套血培养阳性，导管片段培养也是阳性（半定量≥15个菌落），并且为同一种菌：

提示导管相关血流感染（CRBSI）。

   b 如果一套或多套血培养阳性，而导管片段培养阴性：

不能确定为CRBSI；但如果培养出的是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌，而且能排除其他来源的感染，则提示CRBSI。

   c 如果血培养阴性，而导管片段培养阳性，提示是微生物在导管表面定植而非CRBSI。

   d 如果血培养阴性，导管片段培养也是阴性，则不可能是CRBSI。

   2.3.2中心静脉导管及静脉留置口（VAP）

    有两种方法，其中方法一适用于想保留导管的患者，如果已经决定要拔除导管，则方法二更合适。

   方法一：

对疑似CRBSI的患者至少需要采集两套血培养，其中至少一套标本来自外周静脉（注意做好标记），另一套血培养标本需同时或短时间间隔内从导管口或VAP隔膜无菌操作采集（注意做好标记）。

   培养结果的解释：

   a 如果两套血培养均阳性，通过菌种鉴定和药敏试验结果比对确定为同一株微生物，并且缺乏其他感染的证据，提示为CRBSI

   b 如果两套血培养均为阳性，来自导管的血培养的细菌数量（CFU/ml）是外周静脉血培养的5倍以上，并且缺乏其他感染的证据，提示可能为CRBSI（适用于手工定量血培养系统，比如裂解-离心浓缩法）。

   c 如果仅有导管的血培养为阳性：

不能确定为CRBSI，提示为导管定植菌或标本采集过程中的污染菌。

   d 如果仅有来自外周静脉的血培养为阳性，不能确定为CRBSI，但是如果培养出的微生物是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌，并且缺乏其他感染的证据，则提示可能为CRBSI。

确定为CRBSI还需要定量或半定量导管片段培养出相同微生物。

   e 如果两套血培养均为阴性，则不会是CRBSI

   方法二：

通过独立的外周静脉穿刺无菌采集两套血培养；拔出可疑导管，剪取5cm的导管远端的片段送实验室进行Maki’s半定量培养或振荡/超声后定量培养。

   培养结果的解释：

   a 如果一套或多套血培养阳性，同时导管末端培养阳性，而且通过菌种鉴定和药敏试验结果比对确定为同一株微生物，则很可能是CRBSI。

   b 如果一套或多套血培养阳性，而导管末端培养为阴性，如果培养出的微生物是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌，并且缺乏其他感染的证据，则提示可能为CRBSI。

确定为CRBSI还需其他结果支持。

   c 如果血培养阴性而导管末端培养阳性，提示为导管定植菌，不是CRBSI。

   d 如果血培养和导管末端培养均为阴性，则不会是CRBSI。

   2.4感染性细菌性心内膜炎

   血培养结果对感染性心内膜炎的诊断和治疗非常重要。

如果采用较理想的血培养技术，90%以上感染性心内膜炎患者能获得阳性血培养结果。

以下为适用于感染性心内膜炎诊断的特殊规定。

   2.4.1血培养的采集时机

   对于可能的心内膜炎患者，起始采集3套血培养，如果在24小时仍报告为阴性，则继续连续采集2套血培养，一共采集5套血培养。

   a 急性感染性心内膜炎：

   要求：

在经验性抗生素治疗前30min之内采血培养（1~2小时内操作完毕）。

   说明：

对于疑似或已知高毒力病原菌（如金黄色葡萄球菌）所致感染性心内膜炎患者，需要在第一时间立即采血培养以避免治疗上不必要的延误。

   b 亚急性感染性心内膜炎：

   要求：

每隔15min左右收集血液，采集数套血培养。

   说明：

适当的时间间隔有助于证明为持续性菌血症，尤其是当心电图正常或模棱两可时具有更高的临床价值。

   对疑似亚急性感染性心内膜炎的患者，不一定必须在经验性抗生素治疗前采血培养，对这些患者，尝试确定微生物学诊断更为重要。

由于大多数感染性心内膜炎患者菌血症持续存在，使血培养的时间选择相对不是那么重要。

   2.4.2需要的血培养数量

   要求：

先采集3套血培养。

如果这些血培养在24小时内均为阴性，则需再采集2套血培养，总共需采集5套血培养。

   说明：

不同患者最合适的血培养数量可以有所不同，但很清楚，只有一个血培养是一定不够的。

当采集多套血培养时，皮肤菌群常能导致某个血培养阳性。

多套血培养有助于临床医生和实验室从真正的阳性血培养中正确区分由于皮肤污染导致的假阳性。

另外，增加血培养数量相应增加了血培养的采血量，而采血量的增加是提高血培养病原微生物分离率最重要的独立因素。

单个血培养既不能证明持续性菌血症，也无助于区分污染还是真正的菌血症，并且血培养的标本量不够而导致分离率的下降。

   2.4.3需要的培养瓶

   要求：

使用成套血培养瓶（一个需氧瓶和一个厌氧瓶）。

对已经接受抗菌药物治疗的患者，需使用能拮抗或中和抗菌药物抑制作用的血培养瓶（比如有活性炭颗粒或树脂颗粒的血培养瓶）。

   说明：

使用成套血培养瓶能提高某些厌氧菌（比如链球菌，尤其是营养变异链球菌）的检出率。

   临床上疑似感染性心内膜炎的患者经常已经接受抗菌药物治疗，这是此类患者血培养假阴性的独立的最常见的原因。

为了克服这些抗菌药物对病原菌生长的抑制作用，使用能拮抗或中和这种抑制作用的血培养瓶（比如有活性炭颗粒或树脂颗粒的血培养瓶）非常必要。

   造成感染性心内膜炎“培养阴性”的另一个可能原因是由于所谓的“营养变异链球菌”（NVS）存在，它们生长需要维生素B6或半胱氨酸。

目前商品化血培养瓶中都已经添加了这些物质。

如果血培养瓶转种时发现有链状排列的革兰阳性球菌，符合链球菌的特征，但在羊血琼脂平板上不生长，则可能存在营养变异链球菌。

据估计，5~6%的心内膜炎患者存在营养变异链球菌[20]。

   2.4.4血培养所需孵育时间

   要求：

全自动血培养系统的孵育时间为5天。

如果所有5套血培养结果均为阴性，但临床仍怀疑为感染性心内膜炎，则需从所有培养瓶中抽取培养液转种巧克力琼脂平板，并涂片染色镜检。

说明：

对疑似感染性心内膜炎患者的血培养，全自动血培养系统的检测周期也是5天。

以前曾要求对某些导致感染性心内膜炎的苛养菌至少需要孵育两周，但随着检测技术及培养基配方的持续改进已经不再需要这么长时间。

   3.血培养结果的报告方式

   血培养无论是阴性还是阳性结果,都对患者的诊断和治疗非常重要!

尤其是血培养的阳性结果要纳入危机值报告的范畴，建立专门的危机值报告制度，详细记录包括患者信息、标本送检时间、种类及数量、系统阳性报警时间、涂片染色结果以及报告人和告知人等内容，临床科室也应有相应记录。

   建议在已建立实验室信息管理系统（LIS）的医院,应将血培养的情况及时发送到网上，让临床医生随时掌握血培养检测的进展情况。

至少应包括如下内容：

   a实验室已接到申请，但尚未收到标本

   b标本已收到,血培养的数量及检测项目

   c正在检测中，尚无结果

   d24小时无生长

   e48小时无生长

   f系统已阳性报警,阳性报警时间及直接涂片染色镜检结果

   g过夜培养后初步鉴定结果

   h最终鉴定及药敏试验结果

   3.1阳性血培养的分级报告制度

   3.1.1初步报告

   要求:

血培养阳性报警后，应立即抽取培养液进行涂片、革兰染色、显微镜镜检，并将结果向临床主管医生进行紧急口头（电话）报告。

有条件的要在4小时之内将数据录入LIS系统。

   说明:

口头报告包含以下内容，并填写专用危机值报告登记本：

   a患者基本信息

   b标本种类、数量及送检时间

   c系统阳性报警时间（可作为污染菌鉴别的因素之一）

   d报告的时间（临床医生或者护士接到该报告的时间）

   e革兰染色镜检结果。

有经验的实验室工作人员可根据细菌染色及形态特点，在有把握的情况下，可提出倾向性报告，如疑似某种或某类细菌，以便临床能尽早针对性选择合适抗菌药物。

   f实验室报告者全名（或工号）

   g接听电话的临床医生或护士全名（或工号）

   3.1.2二级报告

   要求：

阳性报警的血培养转种培养基培养16~18小时后，观察培养基上菌落形态、革兰染色后菌体形态以及某些试验结果，尽可能通知临床初步鉴定结果和某些耐药特征。

有条件的要在4小时之内将数据录入LIS系统。

   说明：

直接药敏试验可以在有条件的医院先开展。

某些试验如触酶、氧化酶、血浆凝固酶、链球菌分群、MRSA胶乳凝集、β-内酰胺酶等有助于初步鉴定菌种和确定某些菌种的特征性耐药情况。

   如发生二级报告结果与初级报告不相符的情况，需仔细查找、分析原因，并尽快与临床沟通，填写临床告知单，注明变更的内容。

   3.1.3最终（书面）报告

   要求：

报告最终菌种鉴定及药敏试验结果。

有条件的要在4小时之内将数据录入LIS系统。

   说明：

最终报告中应包括初步报告内容。

如发生最终报告结果与初级报告、二级报告不相符的情况，需仔细查找、分析原因，并尽快与临床沟通，填写临床告知单，注明变更的内容。

   3.2其他报告和记录

   要求：

标本被拒收时，需即刻通知临床立即重新采血，并记录在案。

其他需临床注意的事项，如本次采血量不足、标本转运时间过长、标本采集份数不够等信息也要及时与临床沟通，并记录在案。

   4.血培养的污染问题及其鉴别

   要求：

为了将血培养污染最小化，每个实验室必须具有以下措施：

   a注重血培养标本采集技术的培训提高，减少污染的发生；

   b采集合适的血培养套数以便有效检出病原微生物，并能正确区分血培养污染；

   c结合医院血培养开展状况，建立能客观、准确评估血培养阳性菌株是病原菌还是污染菌的标准化程序。

   血培养污染的鉴别：

   a 48小时内仅有这一瓶血培养，则实验室人员需调取患者资料并与临床医生讨论可能的临床价值：

病原菌/污染菌/不能确定。

除非临床要求，不做药敏试验。

   b 48小时内还有另一套或另一瓶血培养，但结果为阴性，则作为污染菌通知临床，除非临床要求，不做药敏试验。

   c 48小时内还有另一套或另一瓶血培养，结果为阳性，如果鉴定结果均为草绿色链球菌，则认为是病原菌，做药敏试验并将结果报告临床；如果鉴定结果均为同一种其他潜在污染菌，则其临床意义不能确定，需与临床医生讨论其可能的临床价值：

病原菌/污染菌/不能确定。

除非临床要求，不做药敏试验。

   说明：

污染导致的血培养假阳性是一个较为普遍的问题，即使采用最好的血培养标本采集方