超高分子聚乙烯颗粒对体外培育成骨细胞活性的阻碍.docx
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超高分子聚乙烯颗粒对体外培育成骨细胞活性的阻碍
超高分子聚乙烯颗粒对体外培育成骨细胞活性的阻碍
刘林许铁秦宏敏韩会峰
【摘要】目的成立小鼠胚胎成骨细胞和超高分子聚乙烯(UHMWPE)颗粒的体外联合培育的新模型,初步研究超高分子聚乙烯颗粒对成骨细胞活性和核心结合因子α1(Cbfα1)表达的阻碍。
方式分为空白对照组和UHMWPE颗粒干与组,2组常规培育小鼠胚胎成骨细胞,待细胞贴壁后装满培育基,UHMWPE颗粒干与组加入UHMWPE颗粒,封锁倒置培育瓶,颗粒漂浮至贴壁细胞层。
应用流式细胞技术分析各组细胞初期凋亡情形。
别离在共培育的第3、五、7天检测细胞Cbfα1在mRNA和蛋白水平上的表达情形。
结果封锁条件下小鼠胚胎成骨细胞正常生长可达10天;UHMWPE颗粒不阻碍细胞增殖活性,对细胞无明显毒性作用;UHMWPE颗粒干与组的目的基因Cbfα1表达增强。
结论超高分子聚乙烯颗粒能够独立、直接阻碍成骨细胞相关因子的分泌。
【关键词】成骨细胞;超高分子聚乙烯颗粒;核心结合因子α1
Abstract:
ObjectiveByestablishinganewmodeltoco-culturemouseembryoosteoblastsandultra-highmolecularweightpolyethylene(UHMWPE)particlesinvitrotostudytheeffectsofpolyethyleneonosteoblastactivityandrelatedfactors′expressioninvolvedinthemechanismofasepticlooseningofarthroprosthesis.MethodsTheexperimentwascarriedoutinablankcontrolgroupandaUHMWPEparticleinterventionthetwogroups,theembryonicmouseosteoblastswereconventionallycultured,withthecultureflaskfilledwithfluidmediumafterthecellsbeganadheringtothevesselwalls,andtheflasksinvertedandsealedsothatthepolyethyleneparticlescouldcontactthecells.After3,5and7daysofincubation,theexpressionofCbfα1wasstudiedbyusingsemi-quantitativeRT-PCRandWesternblottingtechniques.ResultsUnderclosedcondition,thecellscouldkeeponnormalgrowthfornearly10days.TheexpressionofgeneCbfα1wasincreasedintheinterventiongroup,comparedwiththecontrolgroup.ConclusionUHMWPEparticlesdonotaffectthecellproliferation,butcandirectindependentimpactsonthesecretiveactivityofosteoblasts.
Keywords:
osteoblast;UHMWPEparticle;Cbfα1
目前,全世界每一年约有100万关节假体植入,而关节10年失效率几近10%[1-2]。
研究显示,磨损微粒引发假体周围界膜的形成和溶骨现象是造成假体松动的要紧缘故[3]。
参与反映的细胞包括单核巨噬细胞、成骨细胞、成纤维细胞等,这些细胞产生各类细胞因子增进破骨细胞破骨,抑制成骨细胞成骨。
不同浓度的金属、骨水泥和高分子聚乙烯颗粒等对原代成骨细胞[4]或成骨细胞系[5]无毒性作用,但能够刺激上述细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等各类增进骨质丢失的炎症因子。
常规方式无法使超高分子聚乙烯(UHMWPE)颗粒接触到细胞,本研究应用新的体外培育法直接将UHMWPE颗粒加入到小鼠胚胎成骨细胞培育体系中,观看UHMWPE颗粒对成骨细胞增殖情形和骨相关基因核心结合因子α1(Cbfα1)表达的阻碍。
Cbfα1属于runt结构域基因家族的转录因子,是细胞因子诱导成骨的一起的信号分子,小鼠两条Cbfα1等位基因缺失后显现肢体短小、全数的骨组织缺损,证明没有成骨细胞。
有研究证明了Cbfα1除调剂成骨细胞分化外,还操纵诞生后骨骼的形成和发育进程,在成骨细胞的分化和成熟中起重要作用[6-7]。
1材料和方式
实验仪器与材料
要紧仪器CO2孵箱(瑞士Heraeus公司),超净工作台(苏州超净设备厂),离心机(EPPENDORF公司),紫外分光光度计(日本岛津公司)。
要紧材料UHMWPE颗粒(中国矿业大学提供,颗粒形态不规那么,直径为~μm),小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),DMEM、胰蛋白酶、PBS缓冲液、青霉素、链霉素等常规实验耗材(南京基天),AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(ACTGene),rnagents总RNA提取系统(Promega),RT-PCR检测系统(Promega),Cbfα1(SantaCruz公司),辣根过氧化物酶结合的二抗(北京中杉金桥生物技术)。
实验方式
颗粒内毒素的处置将取得的UHMWPE颗粒溶于75%乙醇,室温下震荡洗浴4次,每次1h,再用100%乙醇浸泡留宿,消毒后的颗粒放置7天以使残余环氧乙烷排除,处置后的颗粒悬浮浸泡于培育基中4℃保留。
细胞常规培育小鼠胚胎成骨细胞(中国科学院北京细胞生物所提供)常规培育于含10%胎牛血清、100×103U/L青霉素、100×103U/L链霉素的DMEM培育液中(全培),培育条件为37℃,CO2饱和度为5%,按期观看细胞生长情形,每2天用%的胰酶消化,进行1∶4传代培育。
倒置培育法实验分为空白对照组和UHMWPE颗粒干与组。
待细胞贴壁后向瓶中加满培育基,然后将不同浓度、不同粒径的UHMWPE颗粒加入干与组瓶中并封盖(空白对照组不加任何颗粒),将培育瓶翻转倒置,使粉末贴于细胞生长层面。
应用流式细胞技术分析细胞凋亡情形别离在第3、5天弃掉培育基并用PBS冲洗细胞表面的UHMWPE颗粒,用不含EDTA的胰酶消化细胞,时刻不宜太长,加入1ml冷的PBS液洗涤2次,1000g×10min离心,弃上清液,调整待测细胞的密度为5×105~1×106个/ml;将细胞重悬于500μlBindingBuffer中,同时设立调零组。
向每管加入20μlAnnexinV-FITC和5μl溴化吡啶,轻轻混匀,室温避光反映5min,上机检测。
实验操作重复3次。
总RNA的提取、RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳别离在细胞培育的第3、五、7天弃掉UHMWPE颗粒和培育基,用PBS冲洗贴壁细胞,用%的胰酶消化细胞,离心后依照RNA试剂盒说明提取总RNA,用1%的琼脂糖进行总RNA电泳,并用无RNA酶水溶解,掏出少量稀释后,经紫外分光光度计测定其浓度和纯度,依照测定值调整RNA标本浓度为1g/L。
半定量检测Cbfaα1和内参GAPDH的mRNA的表达情形,RT-PCR反映体系中加入2对引物(具体操作进程参照说明书)。
扩增条件:
Mg2+115mmol/L(具体反映条件见表1)。
正常成骨细胞为阴性对照,所有的实验组与对照组重复3次。
PCR终止后经2%的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后拍照,然后进行灰度分析(ImageJ图像分析软件)并绘制灰度值柱形图。
表1Cbfα一、GAPDHRT-PCR反映条件
Westernblotting分析待融合率达到80%以上时参照SantaCruz公司蛋白提取方式,应用RIPA缓冲液裂解成骨细胞取得总蛋白。
以牛血清蛋白(BSA)作为标准品,依照蛋白定量试剂盒(美国Bio-Rad公司)说明绘制蛋白定量标准曲线,于分光光度计595nm下测光密度值,计算提取液蛋白浓度。
每一样品取20μg,以5∶1的体积与5×SDS加样缓冲液混合,100℃加热3~5min,样品经%SDS-PAGE电泳分离,然后转至硝酸纤维素膜上,5%的脱脂牛奶室温封锁3h,TBST洗膜3次,一抗4℃孵育留宿,TBST洗膜3次,加入1∶1000二抗,室温孵育30~60min,ECL发光显影,薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。
所有的实验组与对照组重复3次。
电泳后进行灰度分析并绘制灰度值柱形图。
统计学处置实验所得数据用x±s表示,利用SigmaStat统计软件进行单因素方差分析,多样本均数之间的比较采纳q查验,P<表示不同有统计学意义。
2结果
细胞的形态学表现传代的细胞呈梭形或柱形,核染色质较疏松,位于细胞的中央,核仁明显,符合成骨细胞的形态学特点,细胞与UHMWPE颗粒能够在盛满培育基的培育瓶中共存至少1周(图1)。
流式细胞技术检测细胞初期凋亡结果空白对照组细胞培育第3、5天细胞凋亡率为%、%,UHMWPE颗粒干与组细胞培育第3、5天细胞凋亡率为%、%,2组比较无统计学意义(P>),见图2。
用AnnexinV-FITC和碘化吡啶染色后,正常的活细胞不被AnnexinV-FITC和碘化吡啶染色(左下角);凋亡初期的细胞仅被AnnexinV-FITC染色,碘化吡啶染色呈阴性(右下角);坏死细胞和凋亡晚期的细胞能够同时被AnnexinV-FITC和碘化吡啶染色(右上角)。
各组RT-PCR结果与空白对照组细胞相较,UHMWPE颗粒干与组细胞Cbfα1的DNA条带亮度增加(图3),灰度值增加(图4),不同有统计学意义(P<)。
成骨细胞Cbfα1蛋白的表达聚丙烯酰胺凝胶电泳结果说明UHMWPE颗粒干与组目的蛋白条带亮度较空白对照组增强(P<)(图5)。
3讨论
本实验培育的成骨细胞呈贴壁生长,形态均匀一致,胞质透明颗粒少,单个核,具有多数学者报导的形态学特点[8-9]。
成骨细胞体外培育为体外研究成骨细胞和骨代谢之间的关系提供了一个体外模型。
通过体外培育能够研究植入材料的生物学特性,如生物相容性、生物毒性等,能够研究骨代谢进程中一些激素和细胞因子调剂的进程和作用机制[10]。
超高分子量聚乙烯(UHMWPE)一样指相对分子质量大于100万的聚乙烯,具有生物相容性、化学稳固性、抗冲击性及耐磨性好和摩擦系数低等优良的性能,作为人工关节窝材料与金属或陶瓷关节头材料组合组成现代人工关节。
可是大量研究报导显示,UHMWPE长期应用存在磨损现象,要紧有2种磨损方式,一种生成剥离片、粒状碎片,一种生成滑腻波纹和微纤。
产生的大部份磨屑为~15μm的粒子和纤维状微粒[11]。
Goodman等[12]在对照金属与骨水泥磨屑中发觉,超高分子聚乙烯磨屑激活巨噬细胞与成纤维细胞作用最强。
临床组织学观看说明[13]:
假体周围最多见、数量最多的是UHMWPE颗粒,与假体周围生物学反映的关系较其他颗粒更紧密,因此UHMWPE颗粒是引发骨溶解和松动的最要紧颗粒,当界膜内超过1×1010/g时,几乎确信发生骨溶解和松动[14],假体寿命明显缩短[15]。
但UHMWPE颗粒较其他颗粒更易引发骨溶解的机制尚未揭露。
本实验作为一种尝试,成功地解决了由于UHMWPE颗粒与成骨细胞共培育所带来的难题。
由于UHMWPE颗粒相对密度较低,漂浮于培育基表面,常规的培育方式无法使UHMWPE颗粒接触到细胞,因此咱们在实验时采纳倒置培育法,将细胞置于培育瓶中培育并使其贴壁,将培育瓶翻转倒置,使贴壁细胞面在上,如此加入UHMWPE颗粒后,细胞即可接触悬浮在液体表面的UHMWPE颗粒,此方式简便、易行。
咱们通过此方式对成骨细胞关键基因及其所表达的蛋白进行研究发觉,UHMWPE颗粒不阻碍细胞增殖活性,对细胞无明显毒性作用,但能够直接孤立地阻碍成骨细胞内源性基因Cbfα1在mRNA水平和蛋白水平上的表达。
说明UHMWPE颗粒造成假体无菌性松动的缘故不是通过直接阻碍成骨细胞的活性,而是通过刺激成骨细胞相关因子的分泌进而间接地作用于破骨细胞等多种细胞组成的细胞网络,该机制尚未完全说明。
该研究项目为说明UHMWPE颗粒所引发的骨质溶解、关节无菌性松动的机制打下了良好的理论及技术基础。
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