电转.docx

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电转

叶绿体转化三角褐指藻表达外源蛋白（朱聪聪）

1.7三角褐指藻叶绿体转化与筛选

离心收集1.0×107～1.0×108个藻细胞，1394×g离心10min，加150uL1.0mol/LNaCl悬浮藻细胞，再加150uL0.1mol/L甘露醇，混匀，冰上放置30min，将藻液转移到0.4cm电激杯内，电激杯内藻液以不超过400uL为宜，同时加质粒pPtcGFP（0.4ug）混匀，将电激杯放置好，调电穿孔仪电容至25F，电阻为400欧，电压为1.5kV，进行电击，将电击后的藻液转移到50mL三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10mL，暗处理2h，再正常培养24h（12L:

12D）收集培养24h后的藻液，155×g离心5min，用f/2（Si-）培养基悬浮藻细胞，将藻细胞涂布于含有氯霉素（400ug.mL－1）的f/2（Si-）固体平板上进行筛选。

挑取在抗性平板上长出的转化子藻落，转接于含有相应浓度抗生素的液体f/2（Si-）培养基中扩大培养。

1．8激光共聚焦扫描显微镜观察

取20uL转化了pPtc-GFP并培养了8d的藻液，置于载玻片上，移至激光共聚焦扫描显微镜下观察，激发光波长为488nm和588nm，分别通过BP505i-530滤镜和LP600滤镜收集绿色荧光和红色荧光。

2．3转基因藻株的鉴定

电穿孔转化三角褐指藻细胞后，经氯霉素抗性筛选，获得的转化藻细胞扩大继代培养。

采用激光扫描共聚焦显微镜对扩大培养的藻细胞进行观察在绿色通道内，转化藻细胞内发出较强的绿色荧光（图3A）；在相同层面上的红色通道内，因叶绿体具有自发的红色荧光，可观察到藻细胞内的椭圆形叶绿体为红色（图3B）；在叠加的照片里，可观察到所有发出在各自通道发出红色或绿色荧光的亚细胞部位均为黄色（图3D），黄色部分表明叶绿体的红色荧光和GFP的绿红色荧光具有很高的重合度因此，表达结果表明，GFP在三角褐指藻叶绿体中成功获得了表达。

传统的叶绿体转化方法多采用基因枪法，但基因枪法所需耗材昂贵，操作复杂。

本研究首次采用电穿孔法将外源基因导入藻细胞的叶绿体中，极大的降低了操作成本且易于操作。

电穿孔过程中，电击的各项参数对转化效率有明显影响，经过多次探索，确定了电容为25F，电阻为400欧，电压为1.5kV的参数下，击后藻的转化效率较高，同时能保证有一定的存活率。

本研究成功建立的三角褐指藻叶绿体表达体系为应用硅藻及其他海洋微藻叶绿体高效表达具有经济价值的蛋白等高附加值产品提供了技术支

以小球藻为载体生产兔防御素的研究（王义琴）

（2）小球藻的电激法转化

取培养4天的小球藻培养液，1000r/min离心10min，收集藻体，用高渗溶液处理1～2h，1000r/min离心10min。

用电激缓冲液调至密度为1×108个/ml。

加入终浓度为10μg/ml的质粒DNA和25μg/ml的鲑精DNA，充分混合均匀，在冰上放置5～10min后电激。

电激的条件：

电场强度分别为6.0～9.5KV，脉冲距离2mm，脉冲持续期为0.05秒，脉冲的次数为210，进行100个循环。

转化后的小球藻经G418筛选，大约3周左右，在固体培养基上即可长出抗性菌落。

通过含G41830μg/L的固体培养基保存藻系，并挑取单藻落，在含有G41815μg/L的液体培养基中扩大繁殖。

杜氏盐藻GFP表达载体的构建及电转化（叶霁）

2.2.3质粒载体电击转化杜氏盐藻细胞

2.2.3.1电转样品的准备

取培养至一定藻龄的藻液，观察细胞的生长状态，测定细胞密度。

离心洗涤，以电击缓冲液悬浮，使细胞密度达到约108个·ml-1，以每管0.2ml的量分装1.5ml离心管。

电转前每管加入鲑鱼精DNA25µg和质粒载体DNA20µl，混匀，置于冰上预冷待电击。

2.2.3.2质粒载体p215t电转参数的设定

实验藻龄有5d,7d和9d;电击缓冲液有1.0mmol·L-1HEPES，1.0mmol·L-1HEPES+0.145mol·L-1甘油和1.0mmol·L-1HEPES+0.5mol·L-1甘油三种；电场强度有5kV·cm-1、6kV·cm-1、7.5kV·cm-1。

其它电转参数为200Ω，25µF，每组3个平行。

在实验1中，固定电场强度和藻龄，研究不同电击缓冲液的转化效果；在实验2中，固定电场强度和电击缓冲液，研究使用不同藻龄进行转化的效果；在实验3中，固定电击缓冲液和藻龄，研究不同电场强度的转化效果。

载体p215t的电转参数组合见附录表1。

2.2.3.3质粒载体p115t电转参数的设定

根据p215t所设参数的电转效果以及甘油生理实验的结果，对p115t的电转参数进行了重新设定。

实验固定了藻龄和电场强度，主要研究了含不同浓度甘油的HEPES电击缓冲液对于电击转化效果的影响。

载体p115t的电转参数组合见附录表2。

2.2.3.4电转后样品的处理

经电击转化处理的样品接种至20ml新鲜DSM，27℃光照培养，光照培养参数见2.2.2.1。

定时观察藻细胞恢复生长的情况，第4天开始荧光镜检。

镜检时，每次取藻液20µl制成水片，荧光显微镜选择430nm蓝色光源，统计转化细胞数量。

蓝光下，野生藻株发出红色荧光，转化藻株发出绿色荧光，易于区分。

规定由第六天镜检所得转化细胞数计算转化率，转化率计算公式为：

采用SAS统计软件分析所得数据，结果见表3。

2.2.4HEPES电击缓冲液中不同浓度的甘油对于转化前细胞存活率的影响[65]

配制含有甘油的HEPES电击缓冲液，使甘油的浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7mol•L-1。

取同一瓶藻种原液分装5ml离心管，每管1ml，3000rpm离心5min去上清；用不同的HEPES电击缓冲液以同样条件离心洗涤细胞1次，再分别加入与洗涤相同的电击缓冲液1ml悬浮藻细胞，室温静置30min；离心去上清，加入新鲜盐藻培养基DSM洗涤沉淀3次，最后加入新鲜DSM1ml，置于27℃光照培养，每组2个平行。

24h后，光学显微镜下利用血球计数板统计活细胞数，结果见图5。

2.2.5甘油对于盐藻细胞生长的影响

配置0.5mol·L-1的甘油母液，向分装于试管的9ml新鲜培养基DSM中分别加入0、20、40、60、80、100、120、140、160、180µl的甘油母液，使培养基中甘油的终浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9mmol·L-1，每组3平行。

自同一瓶藻种原液以10%的接种量分别接种上述培养基，光照培养，参数同2.2.2.1。

培养7d后，从试管中各取100µl藻液，光学显微镜下利用血球计数板进行活细胞计数，方法参照2.2.2.2；其余藻液用于测定生物量，采用紫外可见分光光度计测OD法。

结果见图6和图7。

三角褐指藻叶绿体表达体系的建立及过表达乙酰辅酶A羧化酶（谢伟红）

3.1.4三角褐指藻的电穿孔转化及抗生素筛选阳性藻株

采用电穿孔法（电穿孔仪，Bio-RadGenePulserXcell）将重组质粒pPtc-eGFP导入三角褐指藻细胞。

参照朱聪聪的方法（朱聪聪，2011），具体操作步骤如下：

1）1350g离心收集0.5×107个藻细胞，离心10min，弃上清；

2）加150µl1.0mol·L-1NaCl悬浮藻细胞，再加150µl0.1mol·L-1

甘露醇，轻弹管壁混匀，冰浴30min；

3）将藻液转移到0.4cm电激杯（GenePulser/MicroPulserCuvette,0.4cmgap,Bio-Rad）内，电激杯内藻液以不超过400µl为宜，同时加质粒pPtC-eGFP（0.4µg）混匀；

4）将电激杯放置好，调电穿孔仪电容至25F，电阻为400Ω，电压为1.5kv，进行电击；

5）将电击后的藻液转移到50ml三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10ml，暗处理2h，再正常培养24h（12L12D）；

6）离心收集藻液，1500g离心5min，弃上清，加1ml新鲜培养基重悬；

7）吸取适量藻液涂布在含有200mg·L-1氯霉素的固体培养基上，固体培养基为液体培养基中添加5gl-1浓度的琼脂粉配制而成。

8）将涂布细胞后的培养皿倒置放置在培养箱。

12天后观察转化细胞的生长状况，并查看得到分离的藻落。

挑取阳性藻落，接种于新鲜的不加si的f/2液体培养基中进行扩大培养，培养基含有200mg·L-1的氯霉素。

三角褐指藻遗传转化表达体系的建立（张梦晗）

2.2.6：

表达载体在三角褐指藻内的表达

（1）：

我们通过将eGFP与pHY15进行连接通过电击转化的方式将pHY15质粒导入三角褐指藻内，具体的电击方法如下：

1）按1:

4的比例在f/2无硅培养基中接种三角褐指藻，在23±1℃，于人工气候培养箱中进行培养，光照条件为15/9/光/暗。

2于培养的第6天，即三角褐指藻的对数期，收集50mL藻液，4℃低温离心收集藻细胞，离心机转速为4000rpm,时间为10分钟。

3）向收集的藻细胞中加入450μL1.0molL-1Nacl对藻细胞进行悬浮。

4）向收集到的藻细胞中再加入450μL0.1molL-1甘露醇进行混匀

5）将上述藻细胞的混合液于冰上静置30min。

6）取已经灭菌遇冷的电击杯，向其中加入300μL上述藻细胞混合液，并加入2μL质粒（质粒浓度200ng/μL）.

7）将电击杯至于电穿孔仪中，调好程序为：

电压1.5kv,电容25μF，电阻400Ω。

对藻液进行电击

8）将电击后的藻液转移如50mL的小三角瓶中，并在其中加入10mL新鲜的f/2无硅培养基，在无光环境下培养2h,后转移至正常环境中进行培养24h.

9）离心收集藻细胞，并与含有200mg/L氯霉素的f/2无硅固体培养基上进行涂布，于23±1℃，于人工气候培养箱中进行培养，光照条件为15/9/光/暗。

2周以后挑取藻细胞的单克隆，于50mL的三角烧瓶中进行培养，培养基为含200mg/L氯霉素的f/2无硅培养基。

随时观察单克隆藻细胞在液体培养基中的生长情况，取生长正常的藻株，之后每9天按1:

4的比例重新转接于新鲜的含200mg/L氯霉素的f/2无硅培养基中。

如此转接4次后，待藻株生长稳定后，以不含氯霉素的新鲜f/2无硅液体培养基继续对转基因藻株进行转接3到4次后，与对数期4000rpm离心收集转基因藻，提取藻的DNA及蛋白进行转基因藻的检测及确定。

光诱导表达载体的构建及其在盐藻除草剂抗性转化中的应用（张贵星）

盐藻电激转染方法的建立

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器电激仪（GENEpIJLSER⑧11）及0.2cm电激杯,BIO~RAD公司产品。

1.1.2试剂0.1mol/L甘露醇，1.0mol/L氯化钠。

1.2方法

（l）离心收集1.0x107，盐藻细胞。

（2）用190ul1.0mol/L氯化钠悬浮细胞。

（3）加190ul0.1mol/L甘露醇，混匀。

（4）转移到0.2cm电激杯内。

（5）调电激仪电容至10uF，电阻为400欧。

（6）分别在设定电压0.6kV,，0.8kv，1.0kV，1.2kv，1.5kv，2.0kv电激。

（7）小心转移到试管内，补充PKS培养基500ul，暗处2h使恢复。

（8）光照培养箱液体培养或取50ul涂固体板培养。

2结果与分析

2.1液体培养细胞计数

电激后光照培养箱培养2h4后，对各管内的盐藻用蒸馏水稀释后进行细胞计号对照A设定电压（kV）0石0名1.01.21.52.0细胞数（xlo了）一.1士0112士0210士020名士0107士020石士0102士02表中对照管指未经电激的管。

从表中可以看出,当电激的设定电压为1.ksV时,电激后细胞的数日约为未电激对照管的50%。

2.2固体培养

将电激后的盐藻培养液取50ul涂固体PKS板，6天后观察，如行图:

图18不同电压电激后盐藻细胞的存活率比较（固定电容10吓,电阻400欧。

从照片中我们也可以看出,在电激电压为1.5KV时，盐藻的数日约为对照的一半。

三角褐指藻遗传转化表达体系的建立_张梦晗

表达载体在三角褐指藻内的表达

（1）：

我们通过将eGFP与pHY15进行连接通过电击转化的方式将pHY15质粒导入三角褐指藻内，具体的电击方法如下：

1）按1:

4的比例在f/2无硅培养基中接种三角褐指藻，在23±1℃，于人工气候培养箱中进行培养，光照条件为15/9/光/暗。

2）于培养的第6天，即三角褐指藻的对数期，收集50mL藻液，4℃低温离心收集藻细胞，离心机转速为4000rpm,时间为10分钟。

3）向收集的藻细胞中加入450μL1.0molL-1Nacl对藻细胞进行悬浮。

4）向收集到的藻细胞中再加入450μL0.1molL-1甘露醇进行混匀

5）将上述藻细胞的混合液于冰上静置30min。

6）取已经灭菌遇冷的电击杯，向其中加入300μL上述藻细胞混合液，并加入2μL质粒（质粒浓度200ng/μL）.

7）将电击杯至于电穿孔仪中，调好程序为：

电压1.5kv,电容25μF，电阻400Ω。

对藻液进行电击

8）将电击后的藻液转移如50mL的小三角瓶中，并在其中加入10mL新鲜的f/2无硅培养基，在无光环境下培养2h,后转移至正常环境中进行培养24h.

9）离心收集藻细胞，并与含有200mg/L氯霉素的f/2无硅固体培养基上进行涂布，于23±1℃，于人工气候培养箱中进行培养，光照条件为15/9/光/暗。

2周以后挑取藻细胞的单克隆，于50mL的三角烧瓶中进行培养，培养基为含200mg/L氯霉素的f/2无硅培养基。

随时观察单克隆藻细胞在液体培养基中的生长情况，取生长正常的藻株，之后每9天按1:

4的比例重新转接于新鲜的含200mg/L氯霉素的f/2无硅培养基中。

如此转接4次后，待藻株生长稳定后，以不含氯霉素的新鲜f/2无硅液体培养基继续对转基因藻株进行转接3到4次后，与对数期4000rpm离心收集转基因藻，提取藻的DNA及蛋白进行转基因藻的检测及确定。