生物制药工艺学实验_精品文档文档格式.docx
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将蔗糖粉糊精和生药粉以3:
1:
1的混合粉与浸膏混合制成软材,软材的软硬应适当,以“手握成团,轻压则散”为宜。
采用挤出制粒的方法制成颗粒,颗粒在60-80摄氏度干燥,干燥时应逐渐升温,以免因颗粒表面干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。
颗粒整粒后加入1%硬脂酸镁混合后压片。
四、实验步骤
1.称取太子参22.8g,陈皮2.3g,山药17.1g,山药17.1g,麦芽17.1g,山楂11.4g
2.太子参山药用粉碎机粉成细粉。
3.将上述药材放入烧杯中,加入3倍量的水,煎煮半小时,重复两次,将上清液合并,减压浓缩至浸膏,将所得浸膏放入烘箱中80度干燥。
4.将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3:
1的比例混合制成颗粒软材,将软材放入烘箱中逐渐升温干燥。
5.干燥后的软材加入1%硬脂酸镁放入压片机中压片。
实验二 溶菌酶结晶的制备
1.掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程;
2.学会溶菌酶的结晶和精制方法。
二、实验材料与仪器
新鲜鸡蛋,氯化钠,1mol/L氢氧化钠溶液,醋酸缓冲液,烧杯,玻璃棒,布氏漏斗,干燥箱。
溶菌酶又称细胞壁质酶或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种国内外很紧销的生化物质,广泛应用于医学临床。
具有多种药理作用,能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等,有抗菌的作用,常用于五官科多种粘膜炎症,皮肤带状疮疹等疾病。
是优良的天然防腐剂,可用于食品的防腐保鲜。
尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。
(1)收集鸡蛋清将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞,使蛋清流出(最好是新生的鸡蛋、PH值不得低于8,否则不能使用),按其体积的两倍量加入水,轻轻搅拌5min,使蛋清溶液的稠度均匀,注意在搅拌过程中不能起泡,搅拌不宜过快、搅拌棒应光滑等,以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量,最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。
(2)加入氯化钠按每100ml蛋清溶液加入2g.氯化钠的比例,白蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉,边加边搅拌,促使氯化钠细粉及时溶解,以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部,否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。
(3)粗制溶菌酶加完氯化钠细粉后,再用1mol/L的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的PH值调节到10.8。
在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液PH值时,用胶头滴管将其逐渐滴入并不断搅拌以免局部过碱而导致蛋白质的变性,从而影响溶菌酶的得率和质量。
为加速溶菌酶的结晶过程,可再加入适量的溶菌酶结晶体作为晶种。
低温下静置数天,溶菌酶结晶将慢慢析出,于72~96h达到最高产率。
待结晶完全后,倾去上清液并用布氏漏斗滤出结晶,即可得到粗制的溶菌酶晶体。
(4)精制溶菌酶将制得的粗结晶用PH值4.6的醋酸溶解,然后让酶液静置2h,接着过滤除去不溶物,收集滤液并量出体积,按100ml滤液加5g氯化钠的比例加入(加入方法与第二步加入氯化钠的方法相同)。
然后用1mol/L的氢氧化钠溶液缓慢地将其PH值调节到10.8后,低温下静置结晶。
为加速结晶过程可向酶液中加入溶菌酶晶种,待结晶完全后再倾去上清液,用布氏漏斗过滤可得溶菌酶结晶,如纯度不够,可重复操作提纯,直至达到所需要的纯度为止,结晶于30~40°
:
烘干后即得溶菌酶产品。
(5)包装存贮产品应装于玻璃或陶瓷容器中,置于阴冷处保存,以免溶菌酶受热后失去活性。
注意事项
(1)整个过程只能在玻璃或陶瓷容器中进行,不可用金属容器,以免酶失活而影响产品的得率及质量。
(2)操作的全过程要在低温下进行(10°
以下),防止原料变质和酶失活。
(3)第三步中加入溶菌酶晶种的具体操作是将溶菌酶晶体均匀地悬浮于少量的PH值为10.8,浓度为5%氯化钠溶液中,取几滴加入到调好的PH值和氯化钠浓度的蛋清液内,再置低温处结晶。
实验三纤维素酶活力的测定
1.了解纤维素酶的种类和测定原理,以及纤维素酶的作用特性;
2.掌握3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力的原理和方法。
二、实验原理
纤维素酶是一种多组分酶,包括4种组分:
内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶(又称β-葡聚糖苷酶)。
在各种酶组分的协同作用下,能降解纤维素,使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖等还原糖。
这些还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原,生成红棕色的氨基化合物,在540nm波长处有最大光吸收,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。
利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。
由不同底物测得的酶活力分别称为FPA(滤纸糖酶活力)和CMCA(羧甲基纤维素酶活力)。
为了统一标准,目前通常用滤纸作为纤维素酶作用的底物。
纤维素酶在一定温度和pH条件下,将纤维素底物(滤纸)水解,释放出还原糖。
在碱性、煮沸条件下,3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应,其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。
通过在540nm测其吸光度,可得到产生还原糖的量,计算出纤维素酶的滤纸酶活力。
滤纸酶活力Filterpaperactivity(FPA)指lg固体酶(或1mL液体酶),在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8,中性纤维素酶pH6.0),lh水解滤纸底物,产生出相当于lmg葡萄糖的还原糖量,为1个酶活力单位,以u/g(或u/mL)表示。
三、实验器材和试剂
水浴锅、分光光度计、计时器、比色皿、移液管、吸耳球
DNS试剂、柠檬酸缓冲液、葡萄糖标准储备溶液、快速定性滤纸
四、实验内容
1.葡萄糖标准曲线的绘制:
取7支具塞刻度试管,编号,按照表一规定的量,分别吸取葡萄糖标准液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中,混匀。
将标准管同时置于沸水浴中,反应10min,取出,迅速冷却至室温,用水定容至25ml,盖塞,混匀。
在540nm处测量吸光度,以葡萄糖量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,获得线性回归方程。
表一葡萄糖标准曲线
管号
葡萄糖标准使用溶液
缓冲液吸取量(ml)
DNS试剂吸取量(ml)
浓度(mg/ml)
吸取量(ml)
0.0
0.00
2
3.0
1
1.0
0.50
1.5
3
2.0
4
2.5
5
6
3.5
2.待测酶液的制备
(1)称取酶样1.0g,用柠檬酸缓冲液溶解至100ml(100倍),之后分别做200倍、400倍和800倍稀释,混匀。
准确定容放置10min,待测。
(2)滤纸条的准备
滤纸条事先干燥,水分平衡后,将滤纸折成宽1cm,质量为5±
0.5mg的滤纸条,折成M型备用。
(3)酶活力的测定
取四支具塞试管,将折成M型的滤纸条分别放入每支试管底部,其中一支试管空白,分别向四支试管中加入缓冲液1.5ml,待测酶液0.5ml(空白管不加),使管内溶液浸没滤纸,盖塞。
将四支试管同时置于50℃水浴中,准确计时60min,取出,立即向各管中加入DNS试剂3.0ml。
再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5ml,摇匀。
将四支管同时放入沸水浴中,加热10min,取出,迅速冷却至室温,加水定容至25ml,摇匀。
以空白管(对照液)调仪器零点,在540nm下,测量三支平行管中样液的吸光度,取平均值。
以平均值查标准曲线或用回归方程求出还原糖含量。
(4)酶活力的计算
纤维酶活力按以下公式计算:
X=A×
1/0.5×
n
式中,X-样品的滤纸酶活力,u/g;
A-根据吸光度在标准曲线上查得的还原糖量,mg;
n-酶样的稀释倍数。
实验四 金银花、黄芩、川芎和连翘浸膏的制备
1.掌握提取方法及操作要点。
2.熟悉提取率的测定方法。
3.了解总浸膏量中总黄酮量和总有机酸量的测定方法。
浸膏剂指用适宜溶剂与方法提取中药中有效成分,蒸去全部溶剂,调整浓度至规定标准所制成的膏状或粉状的固体制剂。
除另有规定外,浸膏剂毎1g相当于原有药材的2~5g。
浸膏剂一般用煎煮法或渗漉法制备。
煎煮法指将药材加水煎煮取汁的方法,一般过程为取规定药材,切碎或粉碎成粗粉,置适宜煎器中,加水浸没药材,浸泡适宜时间后,加热至煮沸,保持微沸一定时间,分离煎出液,药渣依法煎出数次(一般为2~3次),至煎液味淡为止,合并各次煎出液,浓缩至规定浓度。
煎煮法适用于有效成分能溶于水,且对湿、热均稳定的药材。
渗漉法是将适度粉碎的药材置渗漉筒中,由上部不断添加溶剂,溶剂渗过药材层向下流动过程中浸出药材成分的方法。
适用于贵重药材、毒性药材及高浓度制剂。
三、实验材料与器材
金银花、黄芩、川芎、连翘、酚酞试剂、NaOH滴定液、0.6%Mg(Ac)2甲醇溶液
索氏提取仪、回流冷凝管、加热套、水浴锅
1.金银花提取
取最粗粉金银花、黄芩、川芎、连翘各20g,加入200ml蒸馏水,按煎煮法,煎煮3次,每次30min,取上清液或过滤取滤液。
2.浸膏制备:
将滤液浓缩至稀糖浆状,静置2周,过滤,即得浸膏。
3.质量检查
(1)观察浸膏的外观性状,本品在水浴上蒸干后,在105℃干燥3小时,至恒定,测定测定总浸膏量。
(2)含量测定
①总有机酸的测定:
在供试品溶液中加入酚酞试剂2滴,用标定好的0.0749mol/L的NaOH滴定液滴定至溶液显粉色。
毎1mlNaOH滴定液相当于9.916mg的水杨酸,总有机酸量以水杨酸计。
②总黄酮的测定:
按《中药化学》中芦丁测定方法,0.6%Mg(Ac)2甲醇溶液为参比,于510nm处测定各溶液吸光值。
实验五 金银花、黄芩、川芎和连翘浸膏的纯化及丸剂的制备
1.掌握泛制法、塑制法制备丸剂的方法与操作要点。
2.熟悉水丸、蜜丸、滴丸对药料和辅料的处理原则及各类丸剂的质量要求。
丸剂是根据中医辨证论治的原则组方。
碾研成细末,混合均匀后,根据处方用蜜、水、黄酒、醋、面糊、米糊、蜂蜡、药汁、流浸膏、糖浆等为粘合剂,制成圆球形的内服固体剂型,如蜜丸、水丸、糊丸、蜡丸、浓缩丸等,以治疗疾病的一种疗法。
丸剂的制法有泛制法、塑制法和滴制法。
泛制法适用于水丸、水蜜丸、糊丸、浓缩丸的制备,其工艺流程为:
原、辅料的准备→起模→成型→盖面→干燥→选丸→质量检查→包装。
塑制法适用于蜜丸、浓缩丸、糊丸、蜡丸等的制备,其工艺流程为:
原、辅料的准备→制丸块→制丸条→分粒、搓圆→干燥→质量检查→包装。
供制丸用的药
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