生物技术综合试验终稿Word文件下载.doc
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2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法
二、基本原理
在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒,大小在1kb-200kb之间,是双链闭合环状的DNA分子。
在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在,其中细菌质粒存在最为普遍,在基因工程中常用作基因载体。
碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法,是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法,此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。
当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、仪器、材料和试剂
1.仪器:
微量移液器、微量离心管(又称Eppendorf管)、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计
2.材料:
含有质粒的大肠杆菌DH5a
3.试剂及溶液:
LB培养基、葡萄糖
质粒小提试剂盒
操作步骤
1.质粒DNA的提取
1)培养细菌:
将带有质粒的单菌落,接种到LB液体培养基中,37oC,200r/min,过夜震荡培养;
2)柱平衡步骤:
向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
(请使用当天处理过的柱子)
3)取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干;
4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1(确保已加入RNaseA),用枪头混匀;
5)向离心管中加入250μl溶液P2,温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
6)向离心管中加入350μl溶液P3,立即温和上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。
12000rpm离心10分钟,此时在离心管底部形成沉淀。
7)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)尽量不要吸出沉淀。
12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
8)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(加入无水乙醇),12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CP3放入收集管中,,12000rmp离心2分钟,目的是将吸附柱中的残留的漂洗液去除。
11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB,温室放置2分钟,12000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。
2.用分光光度计测定质粒DNA的浓度
五、问题讨论
(1)提取质粒DNA有多种方法,所有这些方法都包括3个基本步骤:
培养细胞使质粒扩增;
收集和裂解细菌;
分离和纯化质粒DNA。
可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁,SDS(十二烷基硫酸钠)可使细胞壁裂解。
经溶菌酶和SDS处理后,在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性,而当加入乙酸钾在中性条件下,巨大的染色体DNA分子难以复性,而质粒DNA很快得以复性,离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来,而质粒DNA则留在上清夜中,用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到质粒DNA。
(2)利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法,是定量DNA、RNA常用且快速的方法。
组成核酸的五种碱基(G,A,T,C,U)均在260nm处有强吸收峰,正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。
碱基的种类不同,最大吸收波长以及吸光系数不同,即使是相同碱基,也会随pH的变化,吸光系数也会产生变化,一般在中性附近进行测定。
采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量,对纯度不高的样品,因为糖和蛋白质均具有紫外吸收,常会产生定量不准的结果。
另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收,在定量时需注意,特别是苯酚有很强的吸收,用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。
核酸样品在260nm和280nm波长下均有一定的光吸收值。
如果比较纯的核酸样品,其OD260/OD280是固定的,对DNA样品而言其值大约为1.8-2.2,如高于2.2则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染,因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。
六、试验结果
计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度和纯度。
实验二、双酶切反应
一、实验目的
1.掌握双酶切反应的基本原理
2.掌握双酶切反应获得质粒载体的基本方法
二、实验原理
DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:
Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅱ类由两种酶组成:
一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;
另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
三、实验材料及试剂
实验材料:
实验一获得的PET28a质粒载体
实验试剂:
EcoRI、XhoI、10xHbuffer、灭菌水、冰、37℃水浴
四、双酶切反应体系(20μL)
Hbuffer(10x)
2μL
1μL
EcoRI
0.5μL
XhoI
DNA
4μL
5μL
ddH2O
12μL
3μL
Total
20μL
10μL
五、实验步骤
1)将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪按照体积由大到小的顺序加入上述溶液,再加入重蒸水使总体积为18μl。
2)将管内溶液混匀后加入2μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。
3)混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
4)每管加入2μl0.1mol/LEDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
注:
将加好的反应体系放入37℃恒温水浴锅中反应。
如果是载体,则反映时间为5~6h,如果是DNA则反应时间是1~2h。
附:
(A)
(B)
(C)
BamHI
HindⅢ
1xK
1xm
1.掌握琼脂糖凝胶的制备方法
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法
3.掌握DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用
根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
电泳过程中或电泳完毕,直接利用低浓度的荧光染料EB(溴化乙锭)进行染色,EB可以嵌入核酸双链的配对碱基当中,在紫外激发下,发出荧光,即可确定DNA条带在凝胶中的位置而且灵敏度很高,少知1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。
不同浓度的琼脂糖凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量(%)
线状DNA分子的有效分离范围(Kb)
0.3
5~60
0.6
1~20
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7.0
1.2
0.4~6.0
1.5
0.2~3.0
2.0
0.1~2.0
琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶试剂盒回收酶切产物。
试剂盒中有一个特制的Column,将硅胶填制到这个特制的管中,利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高PH的条件下DNA可以再次被洗脱的原理,进行DNA的回收和纯化。
三、主要实验仪器和试剂
主要仪器:
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。
主要实验试剂:
1、50×
TAE(2MTris,1M醋酸,50mMEDTA(pH8.0))
2、10×
上样缓冲液(loadingbuffer)
3、分子量标准DNAMarker
4、琼脂糖
5、EB(溴化乙锭)(黑暗保存)
6、DNA回收纯化试剂盒(AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒)
四、实验步骤
琼脂糖凝胶的制备:
1、将洗净的电泳槽洗净,置于平整的台面上,并调节水平;
2、用1×
TAE电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖,微波炉加热使其溶解;
3、待琼脂糖溶液冷却至60°
C左右时,缓缓将琼脂糖倒入胶模中,厚度约5至7mm;
4、插入梳子,静待琼脂糖凝固;
5、将胶模放进电泳槽中,向电泳槽倒入1×
TAE电泳缓冲液,没过胶约5mm;
6、小心拔掉梳子,用20ul移液器吸取DNA溶液(20ulDNA加2~3ul10×
loadingbuffer),缓缓加入点样孔;
并在最右边的点样孔加6ulDNAMaker;
7、接通电源,(注意电源的正负极!
)电泳至条带前缘到达胶的2/3左右,约20~30分钟;
8、电泳完毕,关闭电源。
从胶模中取出琼脂糖凝胶,放入EB染色液中,染色6-8min,然后置于紫外灯下观察。
酶切产物凝胶回收:
1、在紫外灯下切下含有目
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