彗星电泳方法整理_精品文档Word格式.docx
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彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重,导致DNA超螺旋结构越松散,产生的断裂点越多,DNA片段越小,从而在彗星尾部出现的DNA断片越多,则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标,可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
随着SCGE技术的发展,可测量的指标也越来越多,而且更准确。
目前,用于SCGE分析的指标主要分为四类,包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。
其中形状指标有彗星细胞率;
距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径;
强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等;
矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标,主观性较强,人为误差较大,而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出,使研究人员的工作量加大。
因此,研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。
近年来,各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件,这些分析软件可以快速提供一系列评价参数,如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等,更好地客观定量DNA损伤。
目前,用于彗星分析的软件包括英国KineticImaging公司的Komet5.5、PerceptiveInstruments公司的CometAssayⅢ、LAI公司的LACAAS、美国NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。
其中的部分软件可以到其相应网站下载,但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用,价格昂贵,提高了研究成本。
新近研发的彗星分析软件(CometAssaySoftwareProject,CASP)很好地解决了这一问题,该软件可以在普通微机上运行,界面友好,使用方便,分析速度快,可以一次同时给出最多达13个指标,分析结果避免了人为误差,更加客观和准确,结果可以以.txt文件直接输出,SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果,便于统计学分析,节省大量人力物力。
中性电泳与碱性电泳
在适合的实验条件范围内,没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。
中性检测DNA双链断裂,碱性检测DNA单链断裂。
根据实验设计的需要,可以选择不同的实验条件,也可以同时选择两种条件,结果进行对比。
拿电离辐射来说,中性和碱性检测的敏感范围不同,碱性SCGE的敏感范围值偏低,如可以小到0.05Gy,而中性SCGE的敏感范围值偏高,它可能检测不到0.05Gy的DNA损伤,但可以检测大到100Gy的损伤,而相对中性SCGE来说,碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。
从修复方面来说,双链断裂的修复较单链断裂的修复慢,损伤重,后果更严重,双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。
从文献上来看,药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE检测单链断裂,
A:
碱性电泳是在1988年建立的,而最开始彗星方法都是在中性条件下做的(1984),所以我认为,这是方法逐步改进的过程。
碱性条件下,DNA解旋,检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤,这样可以提高试验的灵敏度,也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。
B:
中性条件跑出来的是DNA的双链,单链断裂不会出来,而强碱性条件下,破坏了断裂部位连接碱基的氢键,这样,双链断裂也就成了单链形式,可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”,两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。
碱性条件的SCGE的建立也是为了满足不同实验需要。
实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件,如:
电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主,应该选择中性SCGE,而且可以排除环境因素对DNA损伤的影响(因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂--单链为主),如果用碱性的话,就不能区分哪些是实验因素引起的断裂,哪些是其它影响因素引起的断裂。
如果实验致伤因素是以DNA单链为主,那就应该选择碱性SCGE了。
有一点需要说明一下,碱性SCGE确实增加了检测的敏感性(中性SCGE达不到),但牺牲了特异性,DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂,如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。
所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的,对实验结果会或多或少有点影响。
所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。
中/碱性单细胞凝胶电泳
UnwindingoftheDNAandelectrophoresisatneutralpH(7-8)predominantlyfacilitatesthedetectionofdoublestrandbreaksandcrosslinks;
unwindingandelectrophoresisatpH12.1-12.4facilitatesthedetectionofsingleanddoublestrandbreaks,incompleteexcisionrepairsitesandcrosslinks;
whileunwindingandelectrophoresisatapHgreaterthan12.6expressesalkalilabilesites(ALS)inadditiontoalltypesoflesionslistedabove(Miyamaeetal.,1997).
Lysisandelectrophoresiscanbeperformedinalkaline(optionA)orneutral(optionB)conditions.UseoptionAtodetectthecombinationofDNAsingle-strandbreaks,double-strandbreaksandalkali-labilesitesintheDNA,andoptionBtodetectonlyDNAdouble-strandbreaks.
一.玻片处理
1.将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟。
2.用热水将肥皂等污物洗去,再用自来水反复冲洗,最后再用蒸馏水冲洗3~5次。
必要时再置95%乙醇中浸泡1小时,然后擦干或烘干备用。
新玻片常有游离碱质,因此应用清洁液或10%盐酸浸泡24小时,然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
3.用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片,至少过夜(用前最好预热下),再使用,可减少脱胶的问题。
4.Labelslideonfrostedendusingapencil,notapen.
二至四步均应在暗处进行,以避免额外的DNA损伤
performedunderdimyellowlightstopreventDNAdamagethepremiseisthatusuallightingwillcauseDNAdamagebuthavenodatatosupportthisconcern.
先准备裂解液,加应用液组分溶解至清澈后放冰箱!
二.胶的配制与铺设
铺胶后都要加盖片(可不加),目的是使胶平整,凝胶固化后移去盖片,再铺另一层,普通波片表面比较光滑,容易脱胶,文献多用毛玻璃片,应该好一点,但也不能完全避免脱胶。
表1.Samplepreparationbuffer(forplanttissueslicedwithafreshrazorblade)pH7.4
终浓度
组分
100mL
200mL
160mM
NaCl
0.9g
1.8g
8mM(25×
)
Na2HPO4
4mL
8mL
4mM(50×
NaH2PO4
2mL
50mM
Na2EDTA.2H2O
1.9g
3.8g
配胶用PBS(0.1MpH7.4)
用PBS母液配制
表2.制片用胶
10mL
保存
NMPA(0.75%)
0.75g
干燥,除湿
LMPA(0.75%)
0.075g
LMPA75uL+样品25uL,终浓度0.5%
LMPA50uL+样品50uL,终浓度0.5%
4℃保存,37-42℃操作
LMPA(0.5%)
0.05g
第一层:
0.75%正常熔点胶,100µ
l,置于室温>
5min使其固化
在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖,煮沸之后把玻片放进去,让胶液浸过1/3之后,捞出玻片,用布或者别的什么把一面擦干,然后把玻片水平放置,晾干。
*Theslidesmaybeairdriedorwarmedforquickerdrying.Storetheslidesatroomtemperatureuntilneeded;
avoidhighhumidity(湿)conditions.Wegenerallyprepareslidesthedaybeforeuse.
*M.Klaude,S.Eriksson,J.Nygren,andG.Ahnstrom(1996)Thecometassay:
mechanismsandtechnicalconsiderations.MutationRes.363:
89-96.
第二层:
0.75%低熔点胶,75µ
l+25µ
l样品悬液,置于4℃固化1min(也可以把第二层胶配成1%,然后把细胞和胶按照1:
1的比例配,这样细胞多了,终浓度也是0.5%)
附:
三层胶法:
Gentlyslideoffcoverslipandaddathirdagaroselayer(75μLLMPA
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